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生物样品的SEM成像

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扫描电子显微镜(SEM)通常用于在纳米尺度上成像生物材料。光学显微镜使用光来成像样品,大量用于非破坏性图像生物样品,然而,其分辨率和景深是有限的,因此使用SEM来达到更高的分辨率到一纳米。

在SEM中,一束电子通过一系列冷凝器透镜聚焦,然后击中样品。当光束击中样品时,表面的电子被探测器散射并测量。

在本视频中,我们将讨论 SEM 的工作原理,演示如何在实验室中成像生物样本,最后介绍一些用于图像敏感样品的技术。

扫描电子显微镜使用高能电子束,由装有灯丝阴极的电子枪产生。生成的电子被推进到阳极,然后在进入物镜之前使用冷凝器透镜聚焦。对物镜进行校准,将光束聚焦在样品上,在样品表面扫描光栅。电子与样品中原子的相互作用用于研究样品的地形、元素组成和结晶度。当事件电子束撞击表面时,它发出二次和背散射电子。二次电子是从靠近表面的样品中发射的低能电子,提供地形信息。

另一方面,背散射电子被反射到事件光束的相反方向上。交互强度随原子量的增加而增加,使用户能够区分组成差异。需要特别考虑使用 SEM 对生物样品进行成像,因为 SEM 利用高真空,因此通常含水量高的生物样品必须首先干燥。这可能导致敏感样品的结构崩溃,尤其是细胞。因此,细胞用固定剂处理,冲洗,然后缓慢脱水,通过洗涤与增加的乙醇量。

对于刚性生物材料,如本演示中使用的胶原蛋白-羟基磷灰石组织支架,样品在高真空下干燥数天。

最后,由于典型的 SEM 成像需要导电表面,因此生物样品在成像前通常会溅射涂上一层薄薄的金属。现在,我们已经讨论了 SEM 的工作原理以及如何准备用于成像的生物样本,让我们来看看如何准备和成像胶原蛋白-羟基磷灰石组织支架。

首先,使用导电碳胶带将生物材料样品安装到 SEM 存根上,并确保样品干燥且表面无污染。

然后,将安装的样品放入溅射涂层的腔室中,泵下腔室,并溅射覆盖样品约40秒,以达到一个薄,四至六纳米厚的金属涂层,在这种情况下,黄金,具有足够的覆盖。涂覆后,取出样品并使用导电胶带将存根连接到样品顶部,该根根现在涂有导电金属。

最后,将存根安装在 SEM 台上,并拧紧侧面的螺钉。现在,该示例已准备好使用 SEM 进行映像。首先,将舞台装载到 SEM 造型室并密封门,然后按下转移按钮打开从装载室到真空通道的通道。打开内门后,将金属棒拧入舞台,将样品推入真空室,然后拧下金属杆并将其完全缩回装载室,然后按压存储以关闭真空室。

现在,让我们使用 SEM 对示例进行映像。

首先,使用控制器移动舞台,将样品导航到视野中,然后垂直移动样品,直到工作距离为 5 到 10 毫米。打开电子束并选择二次电子的探测器,将光束最初设置为 5 千电子伏特,然后根据需要增加到 20 到 30 千电子伏特。如果图像不清楚,请转动对焦、亮度和对比度旋钮,直到显示清晰的图像。

使用舞台导航和 X 和 Y 方向在样品上定位新点,然后增加放大倍率,直到所需要素可见。根据需要调整对焦、对比度和亮度,以提高图像质量。您可能需要降低扫描速度并打开平均线以获得更好的图像,然后保存图像。

SEM 图像显示了高度三维和多孔结构,纤维特征小于 25 微米。这些特征很难使用光学显微镜进行可视化,因为光学显微镜的景深要低得多。

与SEM的生物结构成像相关的许多挑战,包括结构坍塌或高能电子束的损坏。现在,让我们来看看一般 SEM 技术如何应用于这些类型的敏感样本。精细的生物结构,如这些年轻的植物组织,或那些高含水量,必须通过修复过程,在成像之前处理。

这些花纹立即用新鲜制备的正式林/醋酸固定溶液进行治疗。固定组织在乙醇中解剖,放入网状容器中,并通过乙醇系列70%、80%、90%和100%乙醇脱水。最后,使用关键点干燥机干燥植物组织,安装并涂上薄金属涂层的溅射。

在 SEM 成像后,很明显,未经处理的结构燥过程严重损坏,结构出现相当大的坍塌,而固定结构则保持其原生结构。或者,可以使用环境 SEM 或 ESEM 对细胞和其他高含水量的样本进行成像。ESEM 利用在样品上扫描的栅格的高能电子束,与传统的 SEM 一样,通过保持腔室内的气态环境,实现湿或无涂层样品的成像。

这是通过使用两个孔孔将包含电子枪的高真空室从试样室中分离出来来实现的。电子束确实由于气体分子的散射而蒙受重大损失,但通常是成像的高能量。在这里,细胞生长在硅芯片上,用量子点功能化,并使用谷醛固定协议固定。细胞在水中成像,并显示细胞的未折叠结构,在细胞表面可见单个量子点。

您刚刚观看了 JoVE 关于使用 SEM 可视化生物材料的介绍。您现在应该了解 SEM 的工作原理、生物样品的制备和成像方式,以及该技术在敏感结构上的一些应用。

感谢您的收看!

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