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生体試料のSEMイメージング

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走査型電子顕微鏡、またはSEMは、ナノスケールで生体材料を画像化するためにしばしば使用される。光を用いて試料を画像化する光学顕微鏡は、非破壊的な画像生物学的試料に多く用いられているが、その分解能や被写界深度は限られており、1ナノメートルまで高解像度を実現するためにSEMが用いられる。

SEMでは、電子のビームが一連のコンデンサーレンズを通して集束され、サンプルに当たります。ビームがサンプルに当たると、表面の電子が散乱し、検出器によって測定されます。

このビデオでは、SEMの仕組みについて説明し、実験室で生体試料を画像化する方法を示し、最後に、敏感なサンプルを画像化するために使用されるいくつかの技術を紹介します。

走査型電子顕微鏡は、フィラメントカソードを装着した電子銃によって生成される高エネルギー電子ビームを使用しています。生成された電子は陽極に向かって推進され、次いで、対物レンズに入る前に凝縮器レンズを使用して焦点を合わせられます。対物レンズは、サンプルにビームを焦点を合わせるようにキャリブレーションされ、そこでサーフェス全体でラスタースキャンされます。試料中の原子と電子の相互作用は、サンプルの地形、元素組成、および結晶性を研究するために使用されます。入射電子線が表面に当たると、二次電子と後方散乱電子が放出されます。二次電子は、表面に近いサンプルから放出される低エネルギー電子であり、地形情報を提供します。

一方、後方散乱電子は、入射ビームの反対方向に反射します。相互作用強度は原子量の増加に伴って増加し、ユーザーは組成の違いを区別できます。SEMは高真空を利用するので、SEMを用いた生体試料を画像化するには特別な配慮が必要であり、したがって、通常は含水率の高い生体試料を最初に乾燥させる必要がある。これは、敏感なサンプル、特に細胞の構造の崩壊を引き起こす可能性があります。したがって、細胞は固定剤で処理され、すす、次いで、エタノールの量を増やして洗浄することによってゆっくりと脱水される。

このデモンストレーションで用いたコラーゲン-ヒドロキシアパタイト組織足場のような硬質な生物学的材料の場合、試料は高真空下で数日間にわたって乾燥される。

最後に、典型的なSEMイメージングは導電性表面を必要とするため、生物学的試料は、イメージングの前に金属の薄層で被覆されることが多い。SEMの仕組みとイメージング用の生体試料の調製方法について説明した所で、コラーゲン-ヒドロキシアパタイト組織足場を調製して画像化する方法を見てみましょう。

まず、導電性カーボンテープを使用して生体材料サンプルをSEMスタブに取り付け、試料が乾燥し、表面に汚染がないことを確認します。

次いで、スパッタコーターのチャンバーに取り付けられたサンプルを置き、チャンバーをポンプで下ろし、スパッタコートを約40秒間コーティングして、金属の薄い4〜6ナノメートルの厚さのコーティングを達成し、この場合は金で十分なカバレッジを有する。コーティングしたら、サンプルを取り出し、導電性テープを使用してサンプルの上部にスタブを接続し、現在は導電性金属でコーティングされています。

最後に、SEMステージにスタブを取り付け、側面のネジを締めます。これで、サンプルを SEM でイメージする準備ができました。まず、ステージをSEMチャンバーにロードし、ドアを密封してから、搬送ボタンを押してローディングチャンバーから真空への通路を開きます。内部ドアが開いたら、金属棒をステージにねじ込み、サンプルを真空チャンバーに押し込み、金属棒を外してロードチャンバーに完全に引き込み、店舗を押して真空チャンバを閉じます。

次に、SEM を使用してサンプルをイメージしてみましょう。

まず、コントローラーを使用してステージを移動し、サンプルを視野内に移動してから、作業距離が 5 ~ 10 ミリメートルになるまでサンプルを垂直方向に移動します。電子ビームをオンにして二次電子の検出器を選択し、ビームを最初に5キロ電子ボルトに設定し、必要に応じて最大20~30キロ電子ボルトまで増加させます。画像が鮮明でない場合は、鮮明な画像が表示されるまで、フォーカス、明るさ、コントラストノブを回します。

ステージナビゲーションと X 方向と Y 方向を使用してサンプル上の新しいスポットを見つけ、目的のフィーチャが表示されるまで倍率を上げます。必要に応じてフォーカス、コントラスト、明るさを調整して、画質を向上させます。より良い画像を取得するには、スキャン速度を下げ、ライン平均をオンにしてから画像を保存する必要がある場合があります。

SEM画像は、25ミクロン未満の繊維状の特徴を有する非常に立体的で多孔性の構造を明らかにする。光学顕微鏡の被写界深度がはるかに低いため、光学顕微鏡を使用して視覚化することは困難です。

SEMによる生物構造のイメージングには、高エネルギー電子ビームによる構造崩壊や損傷など、多くの課題があります。次に、一般的な SEM 手法がこれらの種類の機密性の高いサンプルにどのように適用されるかを見てみましょう。これらの若い植物組織のような繊細な生物学的構造、または含水率の高い組織は、イメージングの前に固定プロセスを介して治療されなければならない。

これらの花のメリステムは、すぐに調製したホルマリン/酢酸固定溶液で処理した。固定組織をエタノールで解剖し、メッシュ容器に入れ、70%、80%、90%、100%エタノールのエタノールシリーズを通して脱水した。最後に、植物組織を臨界点乾燥機を用いて乾燥し、取り付け、薄い金属コーティングで覆われたスパッタを取り付けた。

SEMイメージングの後、未処理の構造物が乾燥プロセスによって大きく損傷し、構造が大幅に崩壊し、固定されたものが本来の構造を維持していたことは明らかです。あるいは、細胞および他の高水分含有量の検体は、環境SEM、またはESEMを用いて画像化することができる。ESEMは、従来のSEMと同様に、サンプル上でラスタースキャンされる高エネルギー電子ビームを利用しますが、チャンバ内の気体環境を維持することにより、湿潤または未コーティングサンプルのイメージングを可能にします。

これは、電子銃を含む高真空チャンバーを2つの開口部を用いて検体室から分離することによって行われる。電子ビームは、気体分子による散乱による大きな損失を引き起けますが、通常、イメージングに十分なエネルギーです。ここで、細胞をシリコンチップ上で増殖させ、量子ドットで機能化し、グルタルアルデヒド固定プロトコルを用いて固定した。細胞を水中で画像化し、細胞表面に個々の量子ドットが見える細胞の崩壊していない構造を示す。

SEM を使用した生体材料の視覚化に関する JoVE の紹介を見たばかりです。SEM の仕組み、生物学的サンプルの調製方法と画像化方法、および機密性の高い構造に関する手法の応用について理解する必要があります。

見ていただきありがとうございます!

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