Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

This content is Free Access.

Hebrew
 
Click here for the English version

אליסה אסייס: עקיפה, כריך ותחרותי

Overview

מקור: ויטני סוונסון1,2, פרנסס נגד Sjaastad2,3, ותומאס ס גריפית1,2,3,4
המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
2 המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
3 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של סרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
4 מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455

בדיקות חיסוניות הקשורות לאנזימים (ELISA) משמשות לעתים קרובות למדידת נוכחות ו/או ריכוז של אנטיגן, נוגדן, פפטיד, חלבון, הורמון או ביומולקול אחר במדגם ביולוגי. הוא רגיש ביותר, מסוגל לזהות ריכוזי אנטיגן נמוכים. הרגישות של ELISA מיוחסת ליכולתה לזהות את האינטראקציות בין קומפלקס אנטיגן-נוגדנים יחיד (1). יתר על כן, הכללה של נוגדן אנטיגן מצומד באנזים מאפשרת המרה של מצע חסר צבע למוצר כרומוגני או פלואורסצנטי שניתן לזהות ולהו כמות בקלות על ידי קורא לוחות. בהשוואה לערכים שנוצרו על ידי כמויות titrated של אנטיגן ידוע של עניין, הריכוז של אותו אנטיגן בדגימות ניסיוניות ניתן לקבוע. פרוטוקולי ELISA שונים הותאמו למדידת ריכוזי אנטיגן במגוון דגימות ניסיוניות, אך לכולם יש את אותו מושג בסיסי (2). בחירת סוג ELISA לביצוע, עקיף, כריך, או תחרותי, תלוי במספר גורמים, כולל המורכבות של הדגימות להיבדק ואת נוגדנים ספציפיים אנטיגן זמין לשימוש. ELISA העקיף משמש לעתים קרובות כדי לקבוע את התוצאה של תגובה חיסונית, כגון מדידת הריכוז של נוגדן במדגם. הכריך ELISA מתאים ביותר לניתוח דגימות מורכבות, כגון תרבית רקמות supernatants או lysates רקמה, שבו ניתוח, או אנטיגן של עניין, הוא חלק מדגם מעורב. לבסוף, ELISA התחרותי משמש לרוב כאשר יש רק נוגדן אחד זמין כדי לזהות את האנטיגן של עניין. ELISAs תחרותיים שימושיים גם לאיתור אנטיגן קטן עם אפיטופ נוגדן אחד בלבד שאינו יכול להכיל שני נוגדנים שונים עקב הפרעה סטרית. הפרוטוקול יתאר את ההליכים הבסיסיים לבדיקות עקיפות, כריך ותחרותיות של ELISA.

בדיקת ELISA העקיפה משמשת בדרך כלל למדידת כמות הנוגדנים בסרום או בסופרנטור של תרבות היברידית. ההליך הכללי לבדיקת אליסה העקיפה הוא:

  1. מעיל בארות עם אנטיגנים
  2. הוסף סרום או תרבית היברידית המכילה נוגדן (נוגדן ראשוני או 1° )
  3. דגירה ושטיפה
  4. הוסף נוגדן משני (או 2°) מצומד באנזים
  5. דגירה ושטיפה
  6. הוספת מצע

סנדוויץ ' ELISA מנסח שונה מבדיקת ELISA העקיפה בכך שהשיטה אינה כרוכה בציפוי הצלחות באנטיגן מטוהר. במקום זאת, נוגדן "ללכוד" משמש לציפוי בארות של הצלחת. האנטיגן "תקוע" בין נוגדן הלכידה לנוגדן "זיהוי" שני - שבו שני הנוגדנים ספציפיים לאותו אנטיגן, אך באפיטופים שונים (3). על ידי קשירה לתסביך הנוגדן/אנטיגן, נוגדן האיתור נשאר בצלחת. נוגדנים חד שבטיים או אנטיזרים פוליקלונליים יכולים לשמש כנוגדנים ללכידה וזיהוי. היתרון העיקרי של כריך ELISA הוא כי המדגם לא צריך להיות מטוהר לפני הניתוח. יתר על כן, ההסתה יכולה להיות רגישה למדי (4). ערכות ELISA רבות הזמינות מסחרית הן ממגוון הכריכים ומשתמשות בזוגות נוגדנים תואמים שנבדקו. ההליך הכללי עבור כריך אליסה אסאי הוא:

  1. מעיל בארות עם נוגדן לכידה
  2. הוספת דגימות בדיקה המכילות אנטיגן
  3. דגירה ושטיפה
  4. הוסיפו נוגדן לזיהוי מצומד באנזים.
  5. דגירה ושטיפה
  6. הוספת מצע

רוב ערכות הסנדוויץ' ELISA הזמינות מסחרית מגיעות עם נוגדני זיהוי מצומדים באנזים. במקרים בהם נוגדן זיהוי מצומד באנזים אינו זמין, ניתן להשתמש בנוגדן משני מצומד באנזים הספציפי לנוגדן האיתור. האנזים בנוגדן המשני מבצע את אותו תפקיד, שהוא להמיר את המצע חסר הצבע למוצר כרומוגני או פלואורסצנטי. הנוגדן המשני הנ"ל מצומד באנזים ירצה יותר לשמש בכריך "תוצרת בית" ELISA שפותח על ידי חוקר שיצר נוגדנים חד שבטיים משלהם, למשל. חיסרון אחד בשימוש בנוגדן מצומד משני הוא לוודא שהוא נקשר רק לנוגדן האיתור, ולא לנוגדן הלכידה הקשור לצלחת. התוצאה תהיה מוצר מדיד בכל בארות, ללא קשר לנוכחות או היעדר נוגדן אנטיגן או זיהוי.

לבסוף, ההסתייגות התחרותית של ELISA משמשת לזיהוי אנטיגנים מסיסים. זה פשוט לבצע, אבל זה מתאים רק כאשר האנטיגן המטוהר זמין בכמות גדולה יחסית. ההליך הכללי לבדיקת אליסה התחרותית הוא:

  1. בארות מעיל עם אנטיגן
  2. דגירה ושטיפה
  3. דגימת בדיקה לפני הדגמה עם נוגדנים ראשוניים מצומדים באנזים
  4. מוסיפים את התערובת היטב
  5. לדגור ולשטוף כל נוגדן ראשוני מצומד עם אנזים
  6. הוספת מצע

"התחרות" בבדיקה זו נובעת מהעובדה שיותר אנטיגן בדגימת הבדיקה המשמשת בשלב 3 תגרום לפחות נוגדנים זמינים להיקשר לציפוי האנטיגן של הבאר. לכן, עוצמת המוצר כרומוגגני/פלואורוגניים בבאר בסוף הבדיקה קשורה הפוך לכמות האנטיגן הקיימת במדגם הבדיקה.

מרכיב מרכזי בכל סוג של ELISA הוא הסטנדרטים titrated של ריכוזים ידועים שיאפשרו למשתמש לקבוע את ריכוז אנטיגן נוכח בדגימות הבדיקה. בדרך כלל, סדרה של בארות מיועדות ליצירת עקומה סטנדרטית, שבה כמויות ידועות של חלבון רקומביננטי מטוהר מתווספות לבארות בכמויות יורדות. כאשר בארות אלה מעובדות באותו זמן כמו דגימות הבדיקה, המשתמש יכול לקבל ערכת התייחסות של ערכי ספיגה המתקבלים מקורא מיקרו-לוח עבור ריכוזי חלבון ידועים ללכת יחד עם ערכי הספיגה עבור דגימות הבדיקה. לאחר מכן המשתמש יכול לחשב עקומה סטנדרטית שאליה ניתן להשוות את דגימות הבדיקה לקביעת כמות החלבון של עניין נוכח. העקומה הסטנדרטית יכולה גם לקבוע את מידת הדיוק של יצירת הדילול של המשתמש.

לבסוף, השלב האחרון בכל אחד מסוגי ELISA המפורטים לעיל דורש הוספת מצע. מידת ההמרה של המצע למוצר קשורה ישירות לכמות האנזים הקיימת בבאר. פרוקסידאז חזרת (HRP) ואלקליין פוספטאז (AP) הם האנזימים הנפוצים ביותר שנמצאו מצומדים לנוגדנים. כצפוי, ישנם מספר מצעים זמינים ספציפית עבור אנזים המייצרים מוצר כרומוגני או פלואורסצנטי. יתר על כן, מצעים זמינים במגוון רגישויות שיכולות להגביר את הרגישות הכוללת של ההסתה. המשתמש חייב גם לקחת בחשבון את סוג המכשור הזמין לקריאת הצלחת בסוף הניסוי בעת בחירת סוג המצע לשימוש, יחד עם הנוגדן המתאים לו מצומד באנזים.

מצעים כרומוגניים נפוצים עבור HRP כוללים 2,2'-אזינוביס [3-אתילבזותיאזולין-6-חומצה גופרתית]-מלח דיאמוניום (ABTS) ו-3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), ואילו p-Nitrophenyl פוספט (PNPP) משמש עבור AP. ABTS ו- TMB מייצרים מוצרי תגובה בצבע ירוק וכחול מסיסים במים, בהתאמה. מוצר ABTS הירוק יש שתי פסגות ספיגה עיקריות, 410 ו 650 ננומטר, בעוד המוצר הכחול TMB מזוהה בצורה הטובה ביותר ב 370 ו 652 ננומטר. הצבעים של ABTS ו- TMB משתנים לצהוב בתוספת פתרון עצירה חומצי, אשר מומלץ לקרוא ב 450 ננומטר. פיתוח צבע עבור ABTS הוא איטי, בעוד הוא מהיר עבור TMB. TMB רגיש יותר מ- ABTS, ועשוי לייצר אות רקע גבוה יותר אם התגובה אנזימטית ממשיכה זמן רב מדי. PNPP מייצרת מוצר צהוב מסיס במים לאחר המרת AP שסופג אור ב-405 ננומטר.

Procedure

1. אליסה עקיפה

ELISA עקיף הוא אחד שבו הנוגדן העיקרי אנטיגן ספציפי מזוהה על ידי נוגדן מצומד משני. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה לשיטת ELISA עקיפה, שבה נבדקות דגימות הסרום של עכברים נגועים בשפעת A (IAV) לנוכחות נוגדן IgG ספציפי ל- IAV. כוח אחד של דוגמה זו הוא כי נוגדנים משניים שונים ניתן להשתמש המזהים את כל איזוטיפים נוגדנים או איזוטיפים ספציפיים (למשל, IgG).

ציפוי אנטיגן למיקרו-לוחית

  1. מצופים את בארות של צלחת ELISA 96-well עם אנטיגן מטוהר על ידי צנרת 50 μL של אנטיגן מטוהר (2 מ"ג / מ"ל של A מטוהר A / PR / 8 שפעת וירוס ב 0.05M חוצץ Tris-HCl (pH 9.5)) לתוך כל באר של הצלחת.
  2. מכסים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר אותה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאנטיגן להיקשר לצלחת.
  3. עם השלמת הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.

חסימת

  1. חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות המצולפות על ידי הוספת מאגר חסימה של 200 μL, נעשה שימוש בסרום חמור 5% ב-1X PBS, לבאר. ריאגנטים חלופיים לחסימה כוללים 5% חלב יבש ללא שומן או BSA ב- PBS או סרום רגיל מבעל חיים שבו נוצר הנוגדן המשני.
  2. יש לדגור לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר הדגירה, להסיר את חוצץ חסימה על ידי הבהוב הצלחת ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.

דגירה עם הנוגדן העיקרי

  1. הכן דילול סדרתי של דגימת הסרום, המכילה את הנוגדן העיקרי, כדי להשיג טווח דילול של 1 עד 204,800, באמצעות 1X PBS. כדי לעשות זאת, תחילה לדלל את הסרום 1:12.5 ולאחר מכן לבצע דילול 4X (טווח דילול - 1:12.5 עד 1:204,800).
  2. הוסף 100 μL של דגימות סרום מדולל באופן סדרתי לבארות.
  3. מכסים את הצלחת עם כיסוי דבק ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 1-2 שעות.
  4. לאחר הדגירה, להעיף את הצלחת מעל כיור לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.

דגירה עם הנוגדן המשני

  1. הוסף 100 μL של נוגדן משני מצומד אנזים, peroxidase חזרת, חומר מצומד HRP אנטי עכבר משני בניסוי זה, לכל באר.
  2. לדגור על הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר הדגירה, להעיף את הצלחת מעל כיור ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.

זיהוי

  1. הוסף 100 μL של מצע המחוון (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)) בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל לכל באר.
  2. לדגור על הצלחת עם המצע במשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N חומצה גופרתית (H2SO4).
    בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה, לקרוא את הצלחת באמצעות קורא microplate ב 405 ננומטר כדי לקבוע את ספיגת בארות.

2. כריך אליסה

בגרסת ELISA זו, המדגם הניסיוני "נדחף" בין נוגדן לכידה ללא מעצורים לנוגדן זיהוי מצומד, שניהם ספציפיים לאותו חלבון אך באפיטופים שונים. בדוגמה הבאה של ELISA, ריכוז TNFα אנושי נקבע במדגם לא ידוע באמצעות עקומה סטנדרטית שנוצרה מדילול סדרתי פי 2.5 של TNFα אנושי סטנדרטי ידוע (המציין בריכוז של 75 pg/mL).

ציפוי ללכוד נוגדן למיקרו-לוחית

  1. יש לצפות את בארות של צלחת ELISA 96-באר עם נוגדן לכידה מטוהר על ידי הוספת 100 μL של נוגדן לכידה (1-10 מיקרוגרם / mL טווח) לכל באר של הצלחת.
  2. מכסים צלחת עם כיסוי צלחת דבק ודגרה אותו לילה ב 4°C.
  3. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי מהצלחת על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.

חסימת

  1. חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות מצופות הנוגדנים על ידי הוספת פתרון חסימת 200 μL, 5% חלב יבש ללא שומן המכיל PBS, לבארות.
  2. דגירה של לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או בלילה בטמפרטורה של 4°C.
  3. לאחר הדגירה, להסיר את חוצץ חסימה על ידי הבהוב הצלחת ולאחר מכן לשטוף צלחת עם PBS המכיל 1% Tween-20.

הוספת אנטיגן המכיל דגימות בדיקה

  1. הוסף 100 μL של מדגם הבדיקה לבארות. אוטמים את הצלחת עם כיסוי דבק.
  2. דגירה במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4°C.
  3. לאחר הדגירה, להסיר את הדגימות על ידי הבהוב הצלחת מעל הכיור ולאחר מכן לשטוף את הבארות עם 200 μL 1X PBS המכיל 1% Tween-20.

הוסף נוגדן זיהוי מצומד באנזים

  1. הוסף 100 μL של נוגדן זיהוי מצומד אנזים לבארות בריכוז preoptimized.
  2. אוטמים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
  3. הסר את נוגדן הזיהוי הלא מאוגד על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור ולשטוף את בארות עם 200 μL 1X PBS המכיל 1% Tween-20.

זיהוי

  1. הוסף 100 μL של מצע המחוון בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. כל נוגדן זיהוי מצומד באנזים ימיר את המצע לאות שניתן לזהותו.
  2. לדגור על הצלחת במשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר 5-10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N H2SO4 לבארות. בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה, לקרוא את הצלחת באמצעות קורא microplate כדי לקבוע את ספיגת בארות.

3. אליסה התחרותית

השלבים של ELISA תחרותי שונים מאלה המשמשים עקיפה ו כריך ELISA, עם ההבדל העיקרי להיות שלב מחייב תחרותי בין אנטיגן מדגם ו אנטיגן "תוספת". האנטיגן מדגם הוא דגירה עם הנוגדן העיקרי ללא תווית. מתחמי נוגדנים אנטיגן אלה מתווספים לאחר מכן לצלחת ELISA, אשר כבר מצופה מראש עם אותו אנטיגן. לאחר תקופת דגירה, כל נוגדן לא מאוגד נשטף. יש מתאם הפוך בין כמות הנוגדן החינמית הזמינה לאגד את האנטיגן בבאר לבין כמות האנטיגן במדגם המקורי. לדוגמה, מדגם עם אנטיגן בשפע יהיה יותר אנטיגן ראשוני קומפלקסים נוגדנים, משאיר נוגדן לא מאוגד קטן להיקשר לצלחת ELISA. נוגדן משני מצומד באנזים הספציפי לנוגדן העיקרי מתווסף לאחר מכן לבארות, ואחריו המצע.

ציפוי אנטיגן למיקרו-לוחית

  1. מצופים את בארות של צלחת ELISA 96-well עם 100 μL של אנטיגן מטוהר בריכוז של 1-10 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. מכסים צלחת עם כיסוי צלחת דבק ודגרה הצלחת לילה ב 4°C.
  3. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון אנטיגן מאוגד מן הבארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.

חסימת

  1. לחסום את האתרים הנותרים כריכת חלבון בבארות מצופות על ידי הוספת 200 μL של חוצץ חסימה לכל באר, אשר יכול להיות גם 5% חלב יבש ללא שומן או BSA ב PBS.
  2. לדגור על הצלחת לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4°C.

דגימת דגירה (אנטיגן) עם הנוגדן העיקרי

  1. תוך כדי חסימת הבארות, להכין את תערובת אנטיגן נוגדנים על ידי ערבוב 150 אנטיגן מדגם μL ו 150 μL של נוגדן ראשוני עבור כל באר בבחינה.
  2. לדגור תערובת זו במשך 1 שעה ב 37°C.

הוסיפו לבאר תערובת אנטיגן-נוגדנים

  1. עכשיו, להסיר את מאגר חסימה מן בארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
  2. לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל Tween-20.
  3. הוסף 100 μL של תערובת נוגדנים אנטיגן-ראשוני מדגם.
  4. לדגור על הצלחת ב 37°C במשך 1 שעה.
  5. הסר את התערובת לדוגמה על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.
  6. לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 כדי להסיר כל נוגדן לא מאוגד.

הוסף את הנוגדן המשני

  1. הוסף 100 μL של נוגדן משני מצומד אנזים, אשר במקרה זה הוא נוגדן מצומד AP, לכל באר.
  2. לדגור על הצלחת במשך 1 שעה ב 37°C.
  3. לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20.

זיהוי

  1. הוסף 100 μL של פתרון המצע לכל באר.
  2. המתן 5-10 דקות.
  3. לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 μL 2N חומצה גופרתית לבארות. לאחר מכן, למדוד את הספיגה בקורא מיקרו-לוח בתוך 30 דקות מהוספת פתרון העצירה

Immunosorbent Assay הקשורים לאנזימים, או ELISA הוא מבחן כמותי רגיש מאוד המשמש בדרך כלל למדידת הריכוז של ניתוח כמו ציטוקינים ונוגדנים במדגם ביולוגי. העיקרון הכללי של גיוס זה כרוך בשלושה שלבים: החל מלכידה, או השתקה, של ניתוח היעד על צלחת מיקרו, ואחריו גילוי הניתוח על ידי חלבוני זיהוי ספציפיים למטרה, ולבסוף, תגובת אנזימים, שבה אנזים מצומד ממיר את המצע שלו למוצר צבעוני. בהתבסס על שיטות שונות של לכידה וזיהוי, ELISA יכול להיות מארבעה סוגים: ישיר, עקיף, כריך, ותחרותי.

עבור ELISA ישיר, אנטיגן היעד קשור תחילה לצלחת, ולאחר מכן מזוהה על ידי נוגדן זיהוי ספציפי. שיטה זו משמשת בדרך כלל להקרנת נוגדנים עבור אנטיגן ספציפי. ELISA עקיף משמש לאיתור נוגדנים במדגם על מנת לכמת את התגובות החיסוניות. הלוח מצופה תחילה באנטיגן לכידה ספציפי, אשר משתק את נוגדן המטרה, ומתחם נוגדני אנטיגן זה מזוהה לאחר מכן באמצעות נוגדן שני.

במקרה של כריך ELISA, ניתוח היעד הוא אנטיגן, אשר נתפס על הצלחת באמצעות נוגדן לכידה ולאחר מכן זוהה על ידי נוגדן הזיהוי, ובכך יוצר כריך נוגדן-אנטיגן. שיטה זו שימושית למדידת הריכוז של אנטיגן במדגם מעורב.

ELISA תחרותי משמש כאשר רק נוגדן אחד זמין עבור אנטיגן היעד של עניין. הצלחת מצופה תחילה באנטיגן המטוהר. בינתיים, המדגם המכיל את האנטיגן הוא דגירה מראש עם הנוגדן ולאחר מכן הוסיף לצלחת, כדי לאפשר לכל מולקולות נוגדן חינם להיקשר אנטיגן משותק. גבוה יותר האות מהצלחת, ריכוז האנטיגן במדגם נמוך יותר. בכל ארבעת סוגי ELISA, ישיר, עקיף, כריך, ותחרותי, נוגדן הזיהוי הוא גם מצומד ישירות האנזים או יכול להיות קשור אליו בעקיפין באמצעות נוגדן אחר או חלבון.

האנזימים הנפוצים לתגובה הם peroxidase חזרת או פוספטאז אלקליין עם המצעים המתאימים שלהם, שניהם לייצר מוצר מסיס, צבעוני שניתן למדוד ולכומת באמצעות קורא לוחות. בסרטון זה, תוכלו לראות כיצד לבצע אליסה עקיפה, כריך ELISA, ו ELISA תחרותי, ואחריו דוגמאות של כימות של ניתוח היעד מן השיטות עקיפות וכריך ELISA.

הניסוי הראשון ידגים כיצד להשתמש ELISA עקיף כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדני וירוס נגד שפעת בסרום המתקבל מעכברים נגועים בשפעת.

כדי להתחיל, להוסיף 50 microliters של אנטיגן מטוהר - במקרה זה, 2 מיליגרם למיליליטר של A / PR מטוהר / 8 שפעת וירוס - לכל באר של צלחת ELISA 96 טוב. לאחר מכן, לכסות את הצלחת עם כיסוי דבק ודגור אותו לילה ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר אנטיגן להיקשר לצלחת. למחרת, להסיר את פתרון הציפוי על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור. לאחר מכן, חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות המצוות על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של מאגר חסימה- כאן, סרום חמור 5% ב- 1X PBS - לכל באר. השאירו את הצלחת לדגור לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, להסיר את מאגר חסימה ולאחר מכן לשטוף את הצלחת על ידי הוספת 200 microliters של 1X PBS המכיל 1% Tween-20. מזיזים את הצלחת מעל הכיור פעם נוספת כדי להסיר את הכביסה.

לאחר מכן, להכין את דגימות הבדיקה על ידי הוספת 460 microliters של PBS לצינור טרי, ולאחר מכן הוספת 40 microliters של סרום כדי להפוך 1 עד 12.5 דילול. לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של PBS לצינור שני, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של הדילול הראשון. המשך טווח דילול טורי זה עד לקבלת מדגם סופי עם דילול של 1 עד 204,800. מוסיפים את דגימות הסרום המדוללות באופן סדרתי במשולש לבארות. מכסים את הצלחת בכיסוי דבק ודגר בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, להסיר את הדגימות על ידי הבהוב הצלחת לתוך הכיור ולאחר מכן לשטוף את הצלחת על ידי הוספת 200 microliters של 1X PBS המכיל 1% Tween-20. שוב, להעיף את הצלחת כדי להסיר את הכביסה.

עכשיו, להוסיף 100 microliters של נוגדן משני מצומד אנזים, אשר בניסוי זה הוא peroxidase חזרת, או HRP, חמור מצומד אנטי עכבר משני, לכל באר. לדגור על הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר, ולהעיף את הצלחת כדי להסיר כל נוזל עודף. לשטוף את הצלחת עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 ולאחר מכן להחיל 100 microliters של מצע המחוון בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר לכל באר. לדגור על הצלחת עם המצע במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. בדוגמה זו, חסר הצבע 3,3', 5,5' - tetramethylbenzidine, או TMB, מצע הופך צבע כחול כאשר HRP קיים. לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 microliters של חומצה גופרתית 2N. הדגימות יהפכו צבע צהוב.

תוך 30 דקות מהוספת פתרון העצירה, הכנס את הצלחת לקורא מיקרו-לוח וקרא את הצלחת אורך הגל המתאים למצע כדי לקבוע את ספיגת הבארות.

כדי להתחיל את הכריך ELISA, הצלחת חייבת להיות מצופה בנוגדן לכידה מטוהר. כדי לעשות זאת, להוסיף 100 microliters של נוגדן ללכוד בריכוז בטווח 1-10 מיקרוגרם למיליליטר, לכל באר של צלחת ELISA 96-well. לאחר מכן, לכסות את הצלחת עם כיסוי צלחת דבק ולאחר מכן לדגור על הצלחת לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון הציפוי על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.

עכשיו, לחסום את אתרי כריכת חלבון הנותרים בבארות מצופות על ידי הוספת 200 microliters של 5% חלב יבש דל שומן לבארות. לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר לפחות 2 שעות. לאחר מכן, הסר את מאגר החסימה ולאחר מכן לשטוף את הבארות עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20. הסר את הכביסה על ידי הבהוב הצלחת מעל הכיור. עכשיו, להוסיף 100 microliters של מדגם הבדיקה לבארות, לאטום את הצלחת עם כיסוי דבק, ולאחר מכן לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את הדגימות על ידי הבהוב הצלחת מעל הכיור ולאחר מכן לשטוף את הבארות עם 200 microliters של 1X PBS המכיל 1% Tween-20. הפל את הצלחת מעל הכיור כדי להסיר את הכביסה ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של נוגדן זיהוי מצומד אנזים לבארות.

אוטמים את הצלחת עם כיסוי דבק. השאירו את הצלחת לדגור בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר הדגירה, להסיר את נוגדן גילוי מאוגד על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור לשטוף את הבארות עם 200 microliters של 1X PBS המכיל 1% Tween-20. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של מצע המחוון בריכוז של 1 מיליגרם למיליליטר, ולדגירה את הצלחת במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 microliters של חומצה גופרתית 2N לבארות ולאחר מכן לקרוא את הצלחת בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה בקורא microplate.

כדי לבצע ELISA תחרותי, הראשון מעיל בארות של צלחת ELISA 96 טוב עם 100 microliters של אנטיגן מטוהר בריכוז של 1-10 מיקרוגרם למיליליטר. מכסים את הצלחת בכיסוי צלחת דבק ולאחר מכן לדגור לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את פתרון אנטיגן מאוגד מן הבארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור.

לאחר מכן, חסמו את האתרים הנותרים של כריכת חלבונים בבארות המצופה על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של חסימת מאגר לכל באר - כאן, 5% חלב יבש דל שומן ב- PBS. לדגור על הצלחת לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר. תוך כדי חסימת הבארות, להכין את תערובת אנטיגן נוגדנים ב 1. צינור 5 מיליליטר על ידי הוספת 150 מיקרוליטרים של אנטיגן מדגם ל 150 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני עבור כל באר במבחן. לדגור תערובת זו במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. עכשיו, להסיר את מאגר חסימה מן בארות על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור. לאחר מכן, לשטוף את בארות עם 1X PBS המכיל Tween 20 ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של תערובת נוגדנים אנטיגן מדגם.

השאירו את הצלחת לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, להסיר את תערובת המדגם על ידי הבהוב הצלחת מעל כיור ולאחר מכן לשטוף את הבארות עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 כדי להסיר כל נוגדן מאוגד. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של נוגדן משני מצומד באנזים לכל באר ודגרו את הצלחת במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת עם 1X PBS המכיל 1% Tween-20 ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של פתרון המצע לכל באר. חכה 5-10 דקות. לאחר 10 דקות, לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 100 microliters של חומצה גופרתית 2N ולאחר מכן למדוד את הספיגה בקורא microplate בתוך 30 דקות של הוספת פתרון העצירה.

עבור בדיקת ELISA העקיפה למחצה, נוכחותם של נוגדני וירוס שפעת A בדגימות מדוללות סדרתיות של סרום מעכברים נגועים בשפעת A נקבעה על ידי קריאת הספיגה של כל באר ב 405 ננומטרים בקורא לוחות. נתונים גולמיים אלה מיוצאים לגליון כפולה למטרות חישוב. בניסוי זה, דגימות הסרום המדוללות באופן סדרתי, הנעות בין 1 - 12.5, ל - 1 - 204,800, חזרו על עצמן בשליפליקאט.

כדי לנתח את הנתונים, ערך הספיגה הממוצע מחושב לפיכך עבור כל קבוצה של טריפליקאטים על-ידי הוספת כל הערכים עבור כל דילול וחלוקת הסכום ב- 3. לאחר קביעת הממוצע עבור כל קבוצה של טריפליקאטים, קריאות OD450 הממוצעות מתוותות כנגד הדילול הסדרתי. קריאות OD להקטין כמו הסרום מדולל, המציין כי פחות נוגדנים נמצאים בדגימות מדוללות יותר. בכריך כמותי ELISA, דילול של תקן ידוע, במקרה זה רקומבינציה TNFalpha אנושי, נוספו צלחת 96-well לקרוא יחד עם דגימות לא ידועות.

כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית, חושב ערך הספיגה הממוצע עבור כל קבוצה של קריאות של הריכוזים הידועים. לאחר מכן, ערך הספיגה הממוצע שורטט על ציר ה- y, כנגד ריכוזי החלבון הידועים על ציר ה- x. עקומת התאמה מיטבית מתווספת דרך הנקודות בגרף.

לאחר יצירת העקומה הסטנדרטית, ניתן לקבוע את כמות חלבון TNFalpha במדגם הבדיקה על ידי חישוב תחילה של ערך הספיגה הממוצע עבור מדגם הבדיקה. בדוגמה זו, דגימות הבדיקה נתנו קריאות OD450 של 0.636 ו- 0. 681. הוספת ערכים אלה וחלוקת הסכום ב- 2 מעניקה בממוצע 0.659. מציר ה- y בגרף העקומה הסטנדרטי, הרחב קו אופקי מערך ספיגה זה לעקומה הרגילה. בנקודת ההצטלבות, הרחב קו אנכי לציר ה- x וקרא את הריכוז המתאים אשר, במדגם בדיקה זה, מתאים לריכוז TNFalpha של 38.72 פיקוגרמות למיליליטר.

Results

בדוגמה הבאה של ELISA עקיף, נוכחות של וירוס שפעת A (IAV) ספציפי IgG בסרום של עכברים נגועים IAV נקבע. עכברי C57Bl/6 נדבקו בנגיף שפעת A (A/PR/8; 105 PFU ב-100 μL PBS i.p. ) והנסיוב נאסף 28 ימים לאחר מכן. כדי כמות IgG ספציפית IAV בסרום, 96-טוב צלחות ELISA היו מצופים עם A מטוהר A / PR / 8 שפעת וירוס (50 μL / טוב של 2 מ"ג / מיליליטר וירוס PBS) לילה ב 4 ° C. לוחות מצופים נחסמו למשך שעה בטמפרטורת החדר עם סרום חמורים רגיל של 5% ב- PBS, ואחריו דגירה עם דגימות סרום מדוללות מעכברים מאותגרים על ידי IAV במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הנסיוב היה מדולל בתחילה 1:12.5, ואחריו 1:4 דילול (טווח דילול - 1:12.5 עד 1:204,800). לאחר הכביסה, הצלחות היו דגירה עם פוספטאז אלקליין (AP) - חמור מצומד נגד עכבר IgG במשך 1 שעה. הצלחות נשטפו, ואז נוספה p-Nitrophenyl פוספט (PNPP; 1 מ"ג/מ"ל, 100 μL/well). פתרון PNPP חסר הצבע הופך לצבע צהוב כאשר AP קיים. לאחר 5- 10 דקות, התגובה אנזימטית נעצרה על ידי הוספת 100 μL / well 2N H2SO4. הלוחית נקראה על קורא מיקרו-לוח ב-405 ננומטר. התוצאות המתקבלות מוצגות בטבלה 1 ובאיור 1.

לדוגמה וולס מנת יתר405 התכוון
סרום 1:12.5 A1 2.163 2.194
B1 2.214
C1 2.204
סרום 1:50 A1 1.712 1.894
B1 2.345
C1 1.624
סרום 1:200 A1 1.437 1.541
B1 1.73
C1 1.456
סרום 1:800 A1 1.036 0.957
B1 0.912
C1 0.923
סרום 1:3200 A1 0.579 0.48
B1 0.431
C1 0.429
סרום 1:12800 A1 0.296 0.281
B1 0.312
C1 0.236
סרום 1:51200 A1 0.308 0.283
B1 0.299
C1 0.243
סרום 1:204800 A1 0.315 0.303
B1 0.298
C1 0.297

טבלה 1: נתוני אימות עקיפים של אליסה. דילול סרום (מ- 1:12.5 עד 1:204,800), של עכברים נגועים בשפעת A (IAV) המכילים IgG ספציפי ל- IAV, ערכי צפיפות אופטית (OD) (405 ננומטר) וערכי OD405 ממוצעים.

Figure 1
איור 1: עלילת פיזור עקיפה של ערכי OD405 ממוצעים(+ S. D. ) ודילול סרום (מ- 1:12.5 עד 1:204,800), של נגיף שפעת A (IAV) ספציפי IgG בסרום של עכברים נגועים ב- IAV. ערכי OD405 יכולים להיות מתואמים באופן הפוך לדילול הסרום.

בדוגמה הבאה של כריך ELISA, דילול 1:2.5 של תקני TNFα אנושיים רקומביננטיים (החל בריכוז של 75 pg/mL) נוספה לבארות המצוינות של צלחת שטוחה-תחתונה 96 היטב. תקנים אלה הובילו לשינוי מקביל של פי 2.5 בקריאות הספיגה.

לדוגמה ריכוז (pg/mL) וולס ערכים ערך ממוצע חישוב ריכוז גב ממוצע
תקן 1 75 A1 1.187 1.169 76.376 75.01
A2 1.152 73.644
רגיל 2 30 B1 0.534 0.52 30.827 29.962
B2 0.506 29.098
תקן 3 12 C1 0.23 0.217 12.838 12.105
C2 0.204 11.372
תקן 4 4.8 D1 0.09 0.084 5.055 4.726
D2 0.078 4.398
תקן 5 1.92 E1 0.033 0.031 1.941 1.86
E2 0.03 1.778
תקן 6 0.768 F1 0.009 0.011 0.626 0.764
F2 0.014 0.901
תקן 7 0.307 G1 0.002 0.004 0.238 0.377
G2 0.007 0.516

טבלה 2: נתוני העקומה הסטנדרטיים של כריך TNFα ELISA. דילול של 1:2.5 של תקני TNFα אנושיים רקומביננטיים (75 עד 0.3 pg/mL), ערכי OD (450 ננומטר), ערכי OD450, חישובי ריכוז אחוריים והממוצעים שלהם.

Figure 2
איור 2: עקומה סטנדרטית עבור כריך TNFα ELISA. דילול 1:2.5 של תקני TNFα אנושיים רקומביננטיים (75 עד 0.3 pg/mL) נותח באמצעות כריך ELISA. ניתן לתאם ישירות את ערכי OD450 לריכוז הדילול הסטנדרטי. כמות חלבון TNFα במדגם הבדיקה נקבעה באמצעות העקומה הסטנדרטית, המתאימה לריכוז של 38.72 pg/mL.

לאחר יצירת העקומה הסטנדרטית, נקבעה כמות חלבון TNFα במדגם הבדיקה. בדוגמה זו של ELISA, דגימות הבדיקה נתנו OD450 קריאות של 0.636 ו 0.681, אשר נותנים בממוצע של 0.6585. בעת התוויית קריאת OD450 זו בתרשים לעיל, זה מתאים לריכוז TNFα של 38.72 pg/ml.

Applications and Summary

כפי שהוכח, מגוון של חיסונים (עם שונות קלה בפרוטוקולים) נופלים בתוך משפחת טכניקת ELISA. קביעת הגרסה של ELISA להשתמש תלויה במספר גורמים, כולל מה אנטיגן מזוהה, נוגדן חד שבטי זמין עבור אנטיגן מסוים, ואת הרגישות הרצויה של בדיקת (5). כמה נקודות חוזק וחולשה של ELISAs השונים המתוארים להלן הם:

אליסה החוזק חולשות
עקיפה 1) רגישות גבוהה בשל העובדה כי נוגדנים משניים מצומדים אנזים מרובים יכולים להיקשר לנוגדן העיקרי 1) אות רקע גבוה עלול להתרחש מכיוון שציפוי האנטיגן שמעניין את הצלחת אינו ספציפי (כלומר, כל החלבונים במדגם יספו את הצלחת)
2) נוגדנים ראשוניים רבים ושונים ניתן לזהות על ידי נוגדן משני מצומד אנזים יחיד נותן למשתמש את הגמישות של שימוש באותו נוגדן משני מצומד אנזים ב ELISA רבים ושונים (ללא קשר אנטיגן שזוהה)
3) הבחירה הטובה ביותר כאשר רק נוגדן אחד עבור אנטיגן של עניין זמין
כריך 1) השימוש בנוגדן חד שבטי ייחודי לאנטיגן מגביר את הרגישות והסיחודיות של ה- ASSAY (בהשוואה ל- ELISA העקיף) 1) אופטימיזציה של ריכוזי הנוגדנים המונוקלונליים ללכידה וזיהוי יכולה להיות קשה (במיוחד עבור ערכות לא מסחריות)
2) הבחירה הטובה ביותר לאיתור חלבון גדול עם אפיטופים מרובים (כגון ציטוקינים)
תחרותי 1) ניתן להשתמש בדגימות לא בטוחות 1) דורש כמות גדולה של אנטיגן טהור מאוד לשמש לציפוי צלחת
2) פחות רגישות לאפקטי דילול ריאגנט
3) אידיאלי לאיתור מולקולות קטנות (כגון hapten)

טבלה 3: סיכום. סיכום של נקודות החוזק והחולשה של טכניקות ELISA השונות.

בעוד טכניקה פשוטה ושימושית, יש גם כמה חסרונות לכל ELISA. האחת היא חוסר הוודאות לגבי כמות החלבון העניין בדגימות הבדיקה. אם הסכום גבוה מדי או נמוך מדי, ערכי הספיגה המתקבלים על ידי קורא המיקרו-לוח עשויים ליפול מעל או מתחת לגבולות העקומה הסטנדרטית, בהתאמה. זה יקשה על קביעת כמות החלבון הקיימת בדגימות הבדיקה. אם הערכים גבוהים מדי, ניתן לדלל את דגימת הבדיקה לפני הוספת בארות הצלחת. לאחר מכן יהיה צורך להתאים את הערכים הסופיים בהתאם לגורם הדילול. כאמור, ערכות תוצרת בית דורשות לעתים קרובות אופטימיזציה זהירה של ריכוזי הנוגדנים המשמשים להניב יחס אות לרעש גבוה.

References

  1. Porstmann, T. and Kiessig S.T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  2. Suleyman Aydin. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4-15 (2015).
  3. Gan. S. D. and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology, 133 (9), 1-3 (2013).
  4. Kohl, T. O. and Ascoli C.A. Immunometric Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Cold Spring Harbor Protocols, 1 (6), (2017).
  5. Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., and Morimoto S. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of natural medicines, 72 (1), 32-42 (2018).

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter