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结合:将阿霉素耐药性从捐赠者转移到受体大肠杆菌的方法
 

结合:将阿霉素耐药性从捐赠者转移到受体大肠杆菌的方法

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细菌细胞,如大肠杆菌,能够将遗传信息从细胞转移到细胞。结合不同于DNA转移的其他机制,如转导或转化,因为它需要细胞之间的物理接触。

要继续,结合需要一个表示生育力的供体细胞,或F,因子,没有它的受体细胞,F减细胞。该过程需要两个步骤。第一种是建立直接的细胞对细胞接触。为此,供体细胞产生一种称为性皮毛的细胞外丝状结构。它之所以被命名为这个,因为结合是无性繁殖细菌的交配形式,但应该注意的是,它不是真正的性繁殖,因为没有交换配子,也没有后代形成。

第二步是将DNA输送到受体细胞。性皮鲁斯在两个细胞之间建立接触后,建立了一个称为IV型分泌系统的管道,允许DNA的转移。供体细胞然后开始复制将基于遗传元素(称为OriT或转移源)的遗传元素进行转移的染色体外DNA。新复制的DNA的一端通过DNA蛋白质结合线入导管。随着DNA的进一步复制,它通过通道泵送,由靠近OriT的基因编码的复合蛋白促进。一旦DNA被完全转移,它将形成一个额外的染色体质粒,或者它可能集成到受体细胞的染色体。无论转移的DNA的终点,它编码的基因都会被表达。这种基因表达可用于确认成功的结合。

例如,假设供体菌株表达环青素耐药性,并在结合的DNA中将其传递给受体细菌,但受体菌株也有四环素抗性基因不存在于供体中。在这种情况下,当细胞在含有四环素和氨基青霉素的LB介质上镀时,菌落应只从成功的结合细菌中生长,这将表达两种抗性表型。为了进一步确认成功的结合,可以采集这些菌落的质粒DNA,然后利用聚合酶链反应或PCR放大与转移质粒特有的一段DNA。当 PCR 产品在电泳凝胶上运行,同时与标准尺寸的阶梯一起运行时,已知尺寸的 PCR 片段应在凝胶上可见,从而进一步确认成功结合。在这个实验中,将用质粒将一个质粒通过结合将环青素抗性基因从供体菌株转移到四环素抗受体菌株。在此之后,为了确认结合,结合混合物将孵育在含有两种抗生素的板上,只留下转化的细菌。最后,使用PCR进一步确认成功的结合。

在开始手术之前,请穿上适当的个人防护装备,包括实验室外套和手套。接下来,使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒,以擦拭表面。

在此过程中,阿霉素抗性基因将通过联结从大肠杆菌的WM3064菌株转移到大肠杆菌的J53菌株。供体菌株WM3064对四环素和氨基青霉素具有抗药性,它需要二氨基甲酸(DAP)生长。受体应变 J53 仅对四环素具有抗性,并且不需要 DAP 生长。这意味着成功的结合细胞应耐四环素和环氧西林,并且无需DAP即可生长。

通过接种含有0.3毫摩尔DAP的5毫升LB,用冷冻的供体菌株甘油库存的废料来制备供体菌株培养。然后,通过接种五毫升的LB汤而不用DAP与冷冻受体菌株甘油库存的废料来准备受体菌株。在37摄氏度的温度下生长,在摇动的培养箱中以220RPM的转速进行曝气和摇动。一旦培养物发展到两个的OD 600,从每个培养物中取出一毫升的培养物,然后放入两个新的单独的1.5毫升微离心管中。然后,在3000RPM下将这些等分物离心5分钟,以颗粒细菌细胞。丢弃上清液,用 250 微升 1X PBS 洗净每个颗粒。再次将样品离心,在丢弃上清液后,将每粒颗粒重新悬浮在 500 微升 PBS 中。

为了开始结合过程,首先将50微升的受体细胞与50微升的供体细胞结合在1.5毫升微离心管中,然后通过轻轻上下移液混合。接下来,移液器 100 微升的受体细胞培养液到另一个包含 DAP 的 1X 四环素板上。接下来,通过将受体细胞培养的 100 微升移液至包含 DAP 的非选择性琼脂板上,准备负控制。然后,在37摄氏度的温度下孵育共和负控制板过夜。

第二天,采取无菌细胞刮刀,并通过收集菌落从结合板收获细胞。然后,将菌落转移到含有一毫升1X PBS的无菌1.5毫升微离心管中。重复此过程以从另一个板收集接收细胞。

之后,涡旋样品混合。混合后,将管子转移到离心机,轻轻颗粒细胞。丢弃上清液,然后在一毫升的PBS中清洗细胞颗粒,并涡旋管以重新悬浮细胞。通过离心再次将细胞压过。再次丢弃上清液,并将两个细胞颗粒重新悬浮在一毫升的PBS中。现在,使用无菌移液器尖端,将100微升的偶联反应细胞混合物板到不含1X四环素和1X环二环素的LB琼脂板上。重复电镀方法,使用PBS中同一细胞混合物的100微升稀释到另一个LB琼脂板上,不含1X四环素和1X环素。

最后,将负控制细胞混合物的移液器100微升放在单个LB琼胶板上,仅带1X四环素。在摄氏37度过夜孵育后,群落应可见。使用无菌移液器尖端,从结合反应板中挑选单个菌落,并将其添加到含有五毫升选择性LB培养素的管中,其中含有两种抗生素。然后,通过从受体细胞板中选择单个菌落来重复菌落隔离。在 37 摄氏度下一夜之间生长这些培养物,在 220 RPM 下进行曝气。

第二天,用70%乙醇擦拭台面,从培养箱中取出盘子。使用DNA迷你准备试剂盒从4分离DNA。根据制造商的说明,每种培养的5毫升。完成DNA迷你制备后,使用35微升无核酸酶水洗脱DNA。最后,使用剩余的 0。5毫升每种培养物,通过添加0.5毫升100%甘油来制备一毫升甘油,进行一对一稀释。将这些等分置于零下 80 摄氏度,以便存放,直到需要为止。

为了确认PCR成功结合,首先通过在微离心管中加入75微升的2XPCR主混合物来制备PCR主混合物。然后,加入7.5微升各10微摩尔前引底和10微摩尔反向引基,旨在放大质粒中的环青素抗性基因。接下来,通过将 75 微升的 2X PCR 主混合物添加到微离心管中,然后加入 10 微摩尔前引物和 10 微摩尔反向引物,用于扩增内务基因,从而分别加入 7.5 微升,从而制备第二个 PCR 主混合物,在此例中为 DNA陀螺B。

现在,将15微升的第一个主混合物加入PCR管中,然后加入10毫微克,大约两微升的模板实验DNA到同一管中。使用无核酸酶水将反应调至25微升的最终体积。重复这些步骤以产生其余五个反应,以便管包含此处所示的组件。现在,将这些反应转移到热循环器与块预热到98摄氏度,然后启动程序。PCR 完成后,从机器上拆下管子。然后,将每个反应的两微升与两个微升的加载染料和四微升的分子量标记物混合到1%的甘蔗凝胶的连续井中。将凝胶设置为在 150 伏电压下运行 20 分钟。最后,使用紫外线照明器可视化凝胶。

在实验中,通过PCR证实了阿霉素抗性基因通过结合的成功转移。在这里,在含有结合DNA和安培霉素引种的井中应观察到大约500个碱基对大小的带,在本例中,井中应观察两个。内务管理基因,DNA陀螺B,分别被加载到井三和五与结合的DNA和受体细胞DNA。在这些井中观察到的带子作为正对照,确保DNA模板存在,PCR成功。在包含受体细胞DNA和环霉素引种对反应的孔中不应观察到带,本例中为4,因为受体细胞不耐环西林。此外,在缺乏模板DNA的反应中不应观察到带,此处为6和7井。如果满足这些条件,这将确认环霉素抗性基因的成功转移,使环酸素从WM3064大肠杆菌菌株转移到大肠杆菌的J53菌株。

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