Chemische Trocknung: Biologische Probenvorbereitung für Diescanelektronenmikroskopie (SEM)

- Beginnen Sie zunächst mit der Dehydrierung und Trocknung einer festen Probe, um die Probenverzerrung zu reduzieren, die durch die Entfernung von Gasen und flüssigem Wasser bei dem reduzierten Betriebsdruck herkömmlicher Rasterelektronenmikroskope, SEMs, verursacht wird.

Um die Probe zu dehydrieren, waschen Sie sie mit zunehmenden Ethanolkonzentrationen in Wasser, bis 100% Ethanol erreicht ist. Wiederholen Sie diesen Prozess dann mit einem chemischen Trocknungsmittel in Ethanol, bis die Probe mit reinem Trocknungsmittel gewaschen wird. Geben Sie die Probe und das Trocknungsmittel in eine Verdampfungsschale. Bedecken Sie sie mit minimalem zusätzlichen Trocknungsmittel und lassen Sie es über Nacht in einer Dunsthaube trocknen.

Als nächstes montieren Sie die vorbereitete Probe auf der Oberseite eines Mikroskop-Stubs mit Carbon-Klebeband. Schließlich tragen Sie Silberfarbe an den Rändern des Stubs auf, dann vom Rand des Stubs zu jeder der Proben, um die Ansammlung von überschüssigen Elektronen zu reduzieren, was zu unerwünschten Bildartefakten führen könnte.

In diesem Experiment werden Fruchtfliegen, Drosophila melanogaster, für die SEM-Analyse mit dem Trocknungsmittel HMDS vorbereitet.

- Um Drosophila melanogaster vorzubereiten, tauchen Sie anesthetisierte Fliegen in 1 Milliliter Fixitiv für 2 Stunden bei 4 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass sie vollständig untergetaucht sind.

Verwenden Sie eine Glaspipette, um die Fixitive zu entfernen. Waschen Sie die feste Drosophila Probe in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr dreimal mit 1 Milliliter 0,1 Molar Phosphatpuffer pH 7,2 bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Glaspipette, um jede Wäsche zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht zu entfernen.

Dann dehydrieren Sie die Probe in einem Mikrofuge-Rohr, in einem Volumen von 1 Milliliter, mit einer abgestuften Ethanol-Serie für jeweils 10 Minuten. Verwenden Sie eine Glaspipette, um jede Wäsche zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht zu entfernen. Bewahren Sie die Probe in der 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhre mit gerade genug 100% Ethanol auf, um sie zu bedecken.

Um die chemische Trocknung der Fliegen mit HMDS durchzuführen, ersetzen Sie zunächst die 100% Ethanollösung durch eine 1 bis 2 Lösung von HMDS und 100% Ethanol für 20 Minuten. Ersetzen Sie dann die Lösung für 2 bis 1 Mitarbeit von HMDS und 100% Ethanol für 20 Minuten. Schließlich ersetzen Sie diese Lösung durch 100% HMDS für 20 Minuten, und wiederholen Sie den Vorgang dann einmal.

Übertragen Sie die Probe, die in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und HMDS ist, in eine Einweg-Aluminium-Wägeschale. Ersetzen Sie die 100% HMDS mit gerade genug frischen 100% HMDS, um die Probe zu bedecken. Legen Sie die Probe innerhalb der Aluminiumschale direkt in eine chemische Rauchhaube, um mit einem lockeren Deckel, wie einer Box, zu trocknen, um zu verhindern, dass Schmutz auf die Probe fällt, und lassen Sie es 12 bis 24 Stunden trocknen.

Um Drosophila Beschriften Sie den Boden eines Aluminium-Montagestummels. Verwenden Sie Präzisions-Pinzette, um die getrockneten Fliegen in der gewünschten Position auf einer Carbon-Klebstoff-Registerkarte an der Oberseite eines Stubs unter einem Sezieren Mikroskop gesichert. Tragen Sie Silber leitfähigen Klebstoff um die äußeren Ränder der Stubbs.

Verwenden Sie einen Zahnstocher, um die silberne Farbe mit den Fliegen zu verbinden, um die Leitfähigkeit zu gewährleisten, um sicherzustellen, dass die Farbe nicht den gewünschten Bildbereich berührt. Legen Sie die Stuben in einen Stubhalterkasten. Und legen Sie dann den offenen Stubhalterinin in einen Trockenschrank und lassen Sie die Silberfarbe mindestens drei Stunden trocknen.