Secado químico: Preparación de muestras biológicas para microscopía electrónica de barrido (SEM)

- Para empezar, comience deshidratando y secando una muestra fija para reducir la distorsión de la muestra causada por la eliminación de gases y agua líquida a la presión de funcionamiento reducida de los microscopios electrónicos de barrido convencionales, SEMs.

Para deshidratar la muestra, lávala con concentraciones crecientes de etanol en agua hasta alcanzar el 100% de etanol.

A continuación, monte la muestra preparada en la parte superior de un talón de microscopio utilizando cinta adhesiva de carbono. Finalmente, aplique pintura plateada a los bordes del talón, luego desde el borde del talón hasta cada una de las muestras, para reducir la acumulación de exceso de electrones, lo que podría resultar en artefactos de imagen indeseables.

En este experimento, las moscas de la fruta, Drosophila melanogaster, están preparadas para el análisis sem utilizando el agente de secado HMDS.

- Para preparar Drosophila melanogaster, sumerja las moscas anestesiadas en 1 mililitro de fijación durante 2 horas a 4 grados Centígrados, asegurándose de que estén completamente sumergidas.

Utilice una pipeta de vidrio para eliminar el fixitive. Lave la muestra fija de Drosophila en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros tres veces con 1 mililitro de 0,1 pH 7.2 de fosfato molar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Utilice una pipeta de vidrio para retirar cada lavado, teniendo cuidado de no extraer la muestra.

A continuación, deshidratar la muestra en un tubo de microcombustible, en un volumen de 1 mililitro, utilizando una serie de etanol calificado durante 10 minutos cada uno. Utilice una pipeta de vidrio para retirar cada lavado, teniendo cuidado de no extraer la muestra. Mantenga la muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con suficiente etanol al 100% para cubrirla.

Para realizar el secado químico de las moscas utilizando HMDS, primero, reemplace la solución 100% etanol por una solución de 1 a 2 DE HMDS y 100% etanol durante 20 minutos.

Transfiera la muestra, que se encuentra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y HMDS, en un plato de pesaje de aluminio desechable. Reemplace el 100% HMDS por suficiente HMDS fresco para cubrir la muestra. Coloque la muestra dentro de la platillo de aluminio directamente en una campana química para secar con una tapa suelta, como una caja, para evitar que los desechos caigan sobre la muestra y deje que se seque durante 12 a 24 horas.

Para montar drosophila etiquetar la parte inferior de un talón de montaje de aluminio. Utilice pinzas de precisión para colocar las moscas secas en la posición deseada en una lengüeta adhesiva de carbono asegurada en la parte superior de un talón bajo un microscopio diseccionador. Aplicar adhesivo conductor de plata alrededor de los bordes exteriores de los stubbs.

Utilice un palillo de dientes para conectar la pintura plateada a las moscas, garantizando la conductividad, asegurándose de que la pintura no toque el área de imágenes deseada. Coloque los talones en una caja de soporte de talón.