Vorbereitung von Fixed Drosophila Oocyten für die Immunostainierung: Eine High-Throughput-Methode zur Fixierung und Entfernung der äußeren Membran

- Beginnen Sie mit pulsierenden anästhesierten Drosophila zusammen mit Puffer in einem Mixer, um Fliegen in kleine Stücke aufzubrechen. Filtern Sie die Mischung durch ein Netz, um die großen Körperteile zu entfernen. Dann lassen Sie die Eier sinken, während die größeren Fragmente auf der Oberfläche bleiben und entfernt werden können.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem kleineren Netz, um zusätzliche Schmutz zu entfernen. Sammeln Sie die Eier in einer Durchstechflasche, und wenn die Eier mit einem Medikament behandelt werden sollen, tun Sie dies an dieser Stelle. Als nächstes entfernen Sie die Flüssigkeit und ersetzen Sie sie durch fixative. Fügen Sie Heptan hinzu, um dem Fixativ zu helfen, die Membran um das Ei herum zu durchdringen.

Dann waschen Sie das Fixativ mit PBS weg. Um die Eizellen zu färben, entfernen Sie die schützenden äußeren Membranen, um das Eindringen von Antikörpern zu ermöglichen. Pipette die Eizellen auf den mattierten Teil einer Glasrutsche. Legen Sie einen Deckelrutsch über die Eier und rollen Sie den Deckelrutsch vorsichtig in einer Hin- und Herbewegung, um den Chor ion und vitelline membran mechanisch vom Ei zu trennen.

Im Beispielprotokoll bereiten wir Eizellen in Meiose I vor, um den Spindelapparat zu färben und zu visualisieren.

- Um das Innere einer 5-Milliliter-Röhre und pasteur Pipette mit PTB vorzuschneiden, um zu verhindern, dass Eizellen an den Oberflächen kleben. Fügen Sie 100 Milliliter Robs Puffer zu einem Mixer hinzu und fügen Sie dann 100 bis 300 anästhesierte Fliegen hinzu und pulsieren sie dreimal für eine Sekunde.

Filtern Sie die resultierende Gülle in ein 250-Milliliter-Becherglas durch ein großes Netz mit Poren von rund 1500 Mikrometern. Lassen Sie das Filtrat für etwa zwei Minuten absetzen und dann die deckfreie Schicht ansaugen und so viele große Körperteile wie möglich entfernen. Filtern Sie die Gülle durch ein kleineres Netz mit der Porengröße von 300 Mikrometern wieder in ein 250-Milliliter-Becherglas.

Spülen Sie den ersten Becher mit zusätzlichem Puffer in der beschichteten Pipette, um die restlichen Eizellen zu sammeln. Lassen Sie die Gülle für drei Minuten absetzen und dann alle bis auf die unteren 10 Milliliter absaugen. Gießen Sie so viel wie möglich von den 10 Millilitern in das beschichtete 5-Milliliter-Rohr. Lassen Sie die Gülle für etwa zwei Minuten absetzen und entfernen Sie dann vorsichtig die Flüssigkeit.

Den Rest der 10 Milliliter Gülle dazugeben und die Mischung vor dem Entfernen der Flüssigkeit wieder absetzen lassen. Reste aus dem Becher mit zusätzlichem Puffer in der beschichteten Pipette ausdemspülen. Lassen Sie die Spülung drei bis fünf Minuten im 5-Milliliter-Rohr absetzen.

Um die Eierstöcke zu fixieren, zuerst, aspirieren Sie alle Flüssigkeit aus dem Gewebe, und fügen Sie sofort 1 Milliliter Fixmischung. Legen Sie das Gewebe auf einen Nutator für zweieinhalb Minuten. Als nächstes fügen Sie 1 Milliliter Heptan, Wirbel der Röhre für eine Minute, und dann lassen Sie die Oozyten für eine weitere Minute zu begleichen.

Entfernen Sie alle Flüssigkeit aus dem abgesetzten Gewebe, dann fügen Sie 1 Milliliter 1x PBS. Wirbel das Rohr für 30 Sekunden, und dann lassen Sie die Eizellen für eine Minute zu begleichen. Danach entfernen Sie alle Flüssigkeit aus dem Rohr und füllen Sie es mit fünf Milliliter 1x PBS.

Mit der beschichteten Pipette, fügen Sie etwa 500 bis 1.000 Eizellen zu einem Milchglasschlitten. Entfernen Sie alle fremden Körperteile oder Material mit Zangen. Legen Sie einen Deckelschlupf auf das Gewebe, und rollen Sie die Eizellen sanft, bis alle Membranen entfernt werden. Ziehen Sie die Kante des Deckels über die Eizellen funktioniert gut. Überprüfen Sie den Fortschritt der Membranentfernung unter dem Mikroskop periodisch.