Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Подготовка фиксированных drosophila Oocytes для иммуностиминга

 
Click here for the English version

Подготовка фиксированных drosophila Oocytes для иммуностиминга: метод высокой пропускной способности для исправления и удаления внешней мембраны

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

- Начните с пульсирующей анестезии Drosophila вместе с буфером в блендере, чтобы разбить мух на мелкие кусочки. Фильтр смеси через сетку, чтобы удалить большие части тела. Затем, дайте яйцам утонуть в то время как большие фрагменты остаются на поверхности и могут быть удалены.

Повторите этот процесс с помощью меньшей сетки для удаления дополнительного мусора. Соберите яйца во флаконе, и если яйца должны быть обработаны препаратом, сделайте это в этой точке. Далее, удалите жидкость и замените ее фиксатором.

Затем смойте фиксатор с PBS. Чтобы испачкать яйцеклетки, удалите защитные внешние мембраны, чтобы обеспечить проникновение антител. Pipette oocytes на матовую часть стеклянной горки. Поместите крышку над яйцами и аккуратно свернуть крышку в спину и вперед движение механически отделить хорион и вителлин мембраны от яйцеклетки.

В примере протокола мы будем готовить яйцеклетки при мейозе I для окрашивания и визуализации шпиндельного аппарата.

- Для начала, precut внутри 5-миллилитровой трубки и Пастер пипетки с ПТБ, чтобы предотвратить oocytes прилипания к поверхностям. Добавить 100 миллилитров буфера Роба в блендер, а затем добавить от 100 до 300 анестезированных мух и пульс три раза в течение одной секунды.

Фильтр в результате суспензии в 250-миллилитровый стакан через большую сетку с порами около 1500 микрометров. Пусть фильтруйте поселиться в течение примерно двух минут, а затем аспирировать верхний слой, удаляя как можно больше больших частей тела, как это возможно. Фильтр суспензии снова в 250-миллилитровый стакан через меньшую сетку с поры размером 300 микрометров.

Промыть первый стакан с помощью дополнительного буфера в покрытием пипетки для сбора оставшихся яйцеклеток. Пусть суспензии поселиться в течение трех минут, а затем аспирировать все, кроме нижней 10 миллилитров. Налейте как можно больше из 10 миллилитров, как это возможно в покрытием 5-миллилитровую трубку. Пусть суспензии урегулировать около двух минут, а затем тщательно удалить жидкость.

Добавить оставшуюся часть 10 миллилитров суспензии и дайте смеси осесть еще раз, прежде чем удалить жидкость. Промыть все оставшиеся яйцеклетки из стакана с помощью дополнительного буфера в покрытием пипетки. Пусть промыть поселиться в 5-миллилитровой трубки в течение трех-пяти минут.

Чтобы исправить яичники, во-первых, аспирировать всю жидкость из тканей, и сразу же добавить 1 миллилитр исправить смесь. Поместите ткани на nutator в течение двух с половиной минут. Далее, добавить 1 миллилитр гептана, вихрь трубки в течение одной минуты, а затем позволить яйцеклетки поселиться еще на минуту.

Удалить всю жидкость из оседлой ткани, затем добавить 1 миллилитр 1x PBS. Vortex трубки в течение 30 секунд, а затем позволить яйцеклетки, чтобы поселиться в течение одной минуты. После этого, удалить всю жидкость из трубки и заполнить его с пятью миллилитров 1x PBS.

Используя трубу с покрытием, добавьте примерно от 500 до 1000 яйцеклеток в матовое стекло слайд. Удалить любые посторонние части тела или материала с помощью щипцы. Поместите крышку на верхней части ткани, и осторожно ролл ооцитов, пока все мембраны удаляются. Dragging края крышки через oocytes работает хорошо.

Tags

Пустое значение выпуск
Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter