Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Commencez par les ovocytes matures des ovaires fixes dans une solution saline. Les ovocytes matures portent des coquilles d’œufs composées d’une chorion externe et d’une membrane intérieure vitelline.
Pour enlever mécaniquement la membrane chorion et vitelline, placez les ovocytes entre les parties givrées de deux glissières prétentieuses. Déplacez la glissière supérieure en mouvements droits d’avant en arrière pour créer une friction qui roule les ovocytes.
Maintenant, déplacez la glissière supérieure à un léger angle pour rouler les ovocytes dans une autre direction. En évitant le mouvement circulaire, augmentez cet angle par incréments courts jusqu’à ce que la glissière supérieure se déplace perpendiculairement à la glissière inférieure. Ce mouvement élimine mécaniquement les chorions et les membranes vitelline, permettant l’accès aux sondes ou aux taches dans l’ovocyte.
Les ovocytes sans chorions apparaîtront longs et minces, et ceux qui n’ont pas de membranes vitelline auront des extrémités pointues. Pour séparer les ovocytes dégagés des débris environnants, transférer le mélange d’échantillon dans un tube, et permettre aux ovocytes de s’installer au fond pendant que les débris flottent au sommet et peuvent être enlevés.
Dans ce protocole, nous éliminerons les membranes chorion et vitelline des ovocytes matures de Drosophila.
- Pour séparer les ovocytes à un stade avancé, d’abord, ajouter 1 millilitre de PBSBTx à un plat de dissecting peu profond. Ensuite, utilisez un P200 avec une pointe enduite de BSA pour transférer les ovaires fixes dans le plat peu profond. Pipette les ovaires de haut en bas avec la pointe de pipette enduite de BSA pour déloger les ovocytes matures des ovocytes moins matures.
Lorsque les ovocytes à un stade avancé sont suffisamment séparés, transférez tout le tissu dans un tube de microfuge de 500 microlitres. Retirez l’excès de liquide avec une pipette Pasteur tirée, en laissant environ 150 à 200 microlitres dans le tube.
Pour se préparer au roulement des ovocytes, pré-mouiller un plat bien profond avec 200 microlitres de PBSBTx. Couvrir le plat et le mettre de côté.
Obtenez trois glissières en verre givré et mettez la diapositive trois de côté. Ensuite, frottez doucement les régions de verre givré des diapositives une et deux ensemble. Rincez-les à l’eau déionisée pour enlever les éclats de verre et séchez-les à l’aide d’un lingette jetable. Enduire les régions givrées de diapositives une et deux avec PBSBTx en ajoutant 50 microlitres de PBSBTx à une glissade et en frottant cette région avec l’autre glissière. Retirez le liquide avec un lingette jetable et placez les glissières sous un microscope à disséquer. Gardez les régions givrées de diapositives une et deux en contact avec la diapositive trois soutenant deux.
Pour rouler les ovocytes, d’abord, pré-mouiller une pointe de pipette P200 dans PBSBTx et disperser les ovocytes dans le tube de microfuge en coulissant de haut en bas. Transférer 50 microlitres de liquide contenant les ovocytes au centre de la partie en verre givré de la diapositive 1. Soulevez la diapositive deux pour ce faire.
Baissez lentement la glissière deux jusqu’à ce que la tension de surface du liquide crée un joint entre les deux régions de verre givré. Il devrait y avoir suffisamment de liquide pour couvrir la zone givrée, mais aucune ne devrait s’infiltrer. Ensuite, maintenez la glissière inférieure une en place d’une main et utilisez l’autre main pour déplacer la glissière supérieure deux avant et arrière dans une direction horizontale, en gardant la diapositive deux niveaux et soutenue sur la diapositive trois.
Effectuer au microscope une visualisation facile des mouvements et des progrès des ovocytes. Après quelques mouvements dans la direction horizontale, modifiez légèrement l’angle de mouvement. Par incréments multiples, augmentez graduellement cet angle à 90 degrés jusqu’à ce que le mouvement de la diapositive supérieure deux soit perpendiculaire à la direction de départ. Notez que les chorions vides seront visibles dans le liquide, et les ovocytes dépourvus de chorions apparaîtront plus longs et plus minces.
- Lorsque vous roulez les ovocytes, assurez-vous que la direction du roulement est toujours en ligne droite et jamais un mouvement circulaire.
- Répétez le roulement environ 7 à 10 fois jusqu’à ce que la solution devienne légèrement trouble. Arrêtez de rouler lorsque la majorité des ovocytes semblent avoir perdu leurs membranes vitelline.
Soulevez doucement la glissière supérieure deux, en faisant glisser un de ses coins au centre de la région givré à la diapositive inférieure un de sorte que les ovocytes roulés s’accumulent au centre de la région givré. Rincer les ovocytes des deux diapositives avec PBSBTx dans le plat de puits profond contenant PBSBTx.
Nettoyer les toboggans un et deux avec de l’eau ultrapure. Sécher avec un lingette jetable et réinitialiser. Répétez ces étapes jusqu’à ce que tous les ovocytes du même génotype aient été roulés. Cela nécessite habituellement de trois à quatre tours de roulement par génotype.
Pour enlever les débris après le roulis, ajouter 1 millilitre de PBSBTx à un tube conique de 15 millilitres. Faites tourbillonner le liquide pour enrober les côtés du tube. À l’aide d’une pointe de pipette P1000 recouverte de PBSBTx, transférez les ovocytes roulés du plat du puits profond au tube conique contenant 1 millilitre de PBSBTx. Ajoutez 2 millilitres supplémentaires de PBSBTx au tube conique contenant les ovocytes.
Tenez le tube conique sur un fond sombre pour voir les ovocytes opaques pendant qu’ils coulent. Après avoir laissé les ovocytes s’installer au fond, utilisez un P1000 pour enlever les 2 millilitres de solution principaux contenant des débris et jeter.
Après avoir répété l’étape pour un total de trois tours d’enlèvement des débris, utilisez une pointe de pipette P1000 recouverte de PBSBTx pour transférer les ovocytes vers le tube de microfuge original de 500 microlitres. 20 à 25 femelles devraient produire environ 50 microlitres d’ovocytes matures roulés.
