Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- התחל עם ביציות בוגרות משחלות קבועות בתמיסת מלח. ביציות בוגרות נושאות קליפות ביצים המורכבות מקהלה חיצונית וקרום ויטלין פנימי.
כדי להסיר באופן מכני את ממברנת chorion ו- vitelline, הנח את ביציות בין החלקים הקפואים של שתי שקופיות שטופלו מראש. הזז את השקופית העליונה בתנועות ישרות הלוך ושוב כדי ליצור חיכוך שמגלגל את ביציות.
עכשיו, להזיז את השקופית העליונה בזווית קלה כדי לגלגל את ביציות בכיוון אחר. הימנעות תנועה מעגלית, להגדיל את הזווית במרווחים קצרים עד השקופית העליונה נע בניצב לשקופית התחתונה. תנועה זו מסירה מכנית את chorions וקרומים vitelline, המאפשר גישה עבור בדיקות או כתמים לתוך ביצית.
ביציות ללא כוריות יופיעו ארוכות ודקות, ואלה ללא ממברנות ויטלין יהיו קצוות מחודדים.
בפרוטוקול זה, נסיר כוריון וקרומים ויטלין מן ביציות Drosophila בוגרת.
- כדי להפריד את הביציות בשלב מאוחר, ראשית, להוסיף 1 מיליליטר של PBSBTx לצלחת ניתוח רדוד. לאחר מכן, להשתמש P200 עם קצה מצופה BSA להעביר שחלות קבועות לתוך המנה הרדודה. פיפט השחלות למעלה ולמטה עם קצה פיפטה מצופה BSA כדי לעקור את הביציות הבוגרות מן הביציות בוגרת פחות.
כאשר ביציות בשלב מאוחר מופרדות במידה מספקת, להעביר את כל הרקמה לצינור microfuge 500 מיקרוליטר.
כדי להתכונן לגלגול ביציות, יש להרטיב מראש צלחת עמוקה עם 200 מיקרוליטרים של PBSBTx. מכסים את המנה ומניחים אותה בצד.
השג שלוש מגלשות זכוכית חלביות והגדר שקופית שלוש בצד. הבא, בעדינות לשפשף את אזורי הזכוכית הקפואה של שקופיות אחד ושתיים יחד. ציפוי האזורים הקפואים של שקופיות 1 ו-2 עם PBSBTx על-ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של PBSBTx לשקופית אחת ושפשוף אזור זה עם השקופית השנייה.
כדי לגלגל את הביציות, ראשית, הרטב מראש קצה פיפטה P200 ב PBSBTx ולפזר את הביציות בצינור microfuge על ידי pipetting למעלה ולמטה. העבר 50 מיקרוליטרים של נוזל המכיל את הביציות למרכז חלק הזכוכית הקפואה של שקופית 1. הרם שקופית 2 כדי לעשות זאת.
החלקה נמוכה יותר באיטיות שתיים עד שמתח פני השטח של הנוזל יוצר חותם בין שני אזורי הזכוכית הקפואה.
בצעו תחת מיקרוסקופ להדמיה קלה של תנועות ביציות והתקדמות. לאחר מספר תנועות בכיוון האופקי, שנו מעט את זווית התנועה. במרווחים מרובים, הגדילו בהדרגה זווית זו ל-90 מעלות עד שתנועת השקופית העליונה שתיים תהיה ניצבת לכיוון ההתחלה.
- בעת גלגול ביציות, ודא כי כיוון הגלגול הוא תמיד בקו ישר ולא תנועה מעגלית.
- חזור על גלגול על 7 עד 10 פעמים עד הפתרון הופך להיות מעונן מעט.
הרם בעדינות את השקופית העליונה שתיים, תוך גרירת אחת מפינותיה למרכז האזור הקפוא בשקופית התחתונה כך שהביציות המגולגלות יצטברו במרכז האזור הקפוא.
שקופיות נקיות אחת ושתיים עם מים דקים במיוחד. יבש עם ניגוב ואיפוס חד פעמיים.
כדי להסיר פסולת לאחר גלגול, להוסיף 1 מיליליטר PBSBTx לצינור חרוט 15 מיליליטר. מערבולת הנוזל כדי לצפות את הצדדים של הצינור. באמצעות PBSBTx מצופה P1000 פיפטה קצה, להעביר את ביציות מגולגל מן צלחת עמוקה היטב לצינור חרוט המכיל 1 מיליליטר של PBSBTx. להוסיף 2 מיליליטר נוספים של PBSBTx לצינור חרוט המכיל את ביציות.
החזק את הצינור החרוט על רקע כהה כדי לראות את ביציות אטומות כפי שהם שוקעים. לאחר שנתן ביציות להתיישב לתחתית, להשתמש P1000 כדי להסיר את העליון 2 מיליליטר של פתרון המכיל פסולת להשליך.
לאחר חזרה על השלב בסך הכל שלושה סיבובים של הסרת פסולת, להשתמש PBSBTx מצופה P1000 פיפטה קצה להעביר את ביציות בחזרה לצינור המקורי 500 מיקרוליטר microfuge. 20 כדי 25 נקבות צריך להניב כ 50 microliters של ביציות בוגרת מגולגל.
