Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Når du visualiserer lipiddråper, begynner de intracellulære lagringsorganellene for nøytrale lipider ved å legge til en vaskemiddelløsning, for eksempel en som inneholder Triton X-100, til prøven. Dette vil permeabilisere ormens celler. Deretter fikser du prøven i riktig konsentrasjon av isopropanol, for eksempel 40%.
Deretter legger du Nile Red til prøven og beskytter den mot lys, siden fargestoffet er lysfølsomt. Fiksering gir fargestoffet tilgang til lipiddråper gjennom hele dyret. Nilen Rød er et lipofilt fargestoff hvis fluorescensutslippsspekter avhenger av polariteten til det lokale lipidmiljøet.
Når nile Reds utslippsspekter blir eksponert for polare lipider, som fosfolipider, er det i de høyere, røde bølgelengdene. Når de utsettes for nøytrale lipider, som triacylglyseroler og sterolstere i den nøytrale kjernen av lipiddråper, skifter Nile Reds utslippsspekter til de nedre bølgelengdene i gult gull.
Bruk derfor den grønne kanalen til et fluorescerende mikroskop, som vil samle de gule gullbølgelengdeutslippene, for å visualisere Nil Rød farging av lipiddråper gjennom hele dyret. I eksempelprotokollen vil vi se en Nil Rød fargingsprosedyre og avbildning av lipiddråper i faste prøver.
- For å utføre Nilen Rød lipidfarging, plate ormer på nematode vekstmedium, eller NGM, frø med sen logg OP50 E. coli, og vokse ormene ved 20 grader Celsius til tidlig L4 stadium. Vask ormene med 1 milliliter PBST-løsning og overfør ormeopphenget til et 1,5 milliliter mikrofugerør.
Sentrifuger ormene ved 560 ganger tyngdekraften i ett minutt, fjern deretter supernatanten og gjenta PBST-vasken til E. coli er fjernet fra suspensjonen. Deretter legger du til 100 mikroliter av 40% isopropanol, eller 60% for ORO-farging, og inkuberer prøven ved romtemperatur i tre minutter.
- Tilsetning av isopropanol er avgjørende for riktig permeabilisering av ormene før farging.
- Sentrifuger ormene ved 560 ganger tyngdekraften i ett minutt og fjern supernatanten uten å forstyrre ormepellet.
- Det er viktig å minimere lyseksponering under sentrifugeringstrinnene.
- Nå, mens du er i mørket, tilsett 600 mikroliter av tidligere tilberedt NR-arbeidsløsning til hver prøve. Inverter rørene tre ganger og bland ormene og løsningen fullt ut.
Etter inkubasjon, sentrifuger ormene og fjern supernatanten. Tilsett deretter 600 mikroliter PBST og inkuber prøvene i mørket i 30 minutter for å fjerne overflødig NR-flekk. Etter å ha snurret prøvene igjen som før, fjern alle unntatt ca. 50 mikroliter supernatant.
