Encyclopedia of Experiments: Biology
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Transcript
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- Per iniziare, aggiungere la carbenicillina e un IPTG millimolare per controllare e testare i flaconi di coltura contenenti mezzi basali S. Ruotare un tubo contenente larve nella fase di crescita uno, chiamato anche larve L1, per alcuni minuti. Ora rimuovere il supernatante e posizionare due microlitri di L1 su una piastra di agar. Posizionare la piastra sotto un microscopio sezionante e contare il numero di larve.
Aggiungere batteri RNAi che trasportano un plasmide RNAi non specifico al pallone di controllo e batteri con RNAi di puntamento genico al pallone di prova. La quantità di batteri aggiunti deve essere proporzionale al numero di vermi.
Lasciate crescere le larve con continui scuotimenti per garantire una corretta ossigenazione. Le larve si nutrono dei batteri. All'interno della larva, il piccolo RNA interferente si lega all'mRNA complementare prodotto dal gene mirato e inibisce l'espressione proteica. Infine, esaminate i vermi per il fenotipo di interesse.
Nel protocollo di esempio, tratteremo le larve L1 con RNAi che prendono di mira il gene daf-2, in coltura liquida.
- Per iniziare il trattamento, aggiungere 207,45 millilitri di mezzi basali S con reagenti aggiuntivi come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento a un pallone da coltura Fernbach da 2.800 millilitri. Aggiungere una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro di carbenicillina e 1 millimolare di IPTG e chiudere il pallone con un tappo a vite a membrana.
Togliere gli L1 dall'incubatore di 25 gradi Celsius e trasferirli in tubi da 15 millilitri. Centrifugare l'L1 a 1.900 volte g per tre minuti. Dopo la filatura, rimuovere il supernatante. Al microscopio, contare l'L1 per due microlitri e in media i numeri ottenuti da almeno nove gocce.
Aggiungere quindi 50.000 vermi per la raccolta di giovani vermi e 100.000 vermi per la raccolta di vermi invecchiati in quattro contenitori di coltura fernbach preparati nella fase precedente. Aggiungere quindi i batteri RNAi di controllo e i batteri RNAi per il gene di interesse proporzionalmente al numero di vermi.
Dopo aver aggiunto batteri, completare la coltura del verme con S basale per portare il volume totale a 300 millilitri. Incubare la coltura del verme a 25 gradi Celsius in un'incubatrice tremante con 150 RPM fino alla raccolta.
