Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For denne disseksjonen, bruk to mikropipetter: en med åpning omtrent samme bredde som et egg og en som er dobbelt så bred, og en rekke løsninger organisert i brønner for å lette rask overføring mellom dem.
Først legger du voksne hermafroditter i eggesaltoppløsning, som er osmotisk balansert for å forhindre at embryoer sprekker. Kutt ormene i halvparten for å frigjøre de utviklende embryoene.
Identifiser deretter tocellede stadiumembryoer. Disse cellene er blastomerene dannet av oppdelingen av det befruktede egget. Bruk mikropipetten med større åpning for å overføre et embryo til hypoklorittoppløsning, blekemiddel, som begynner å bryte ned det beskyttende eggeskallet.
Etter bare 40 til 55 sekunder, overfør embryoet til Sheltons vekstmedium, eller SGM. Vask hvert embryo kort i to brønner med SGM for å fjerne alle spor av blekemiddelet før du plasserer dem i en tredje brønn.
Bruk nå den mindre mikropipetten til gjentatte ganger å pipette embryoet som gir den mekaniske kraften til å fjerne eggeskallet og eksponere blastomerene. Fortsett forsiktig å pipette embryoet for å skille de enkelte blastomercellene. I følgende protokoll vil vi se denne teknikken i aksjon.
- Hold hver ende av en mikrokapsel med en kapasitet på 10 mikroliter med høyre og venstre hånd. Trekk mikrokapselen mot begge ender for å påføre spenning og bringe midten av kapillæren over en brenner for å lage to håndtrekkede kapillærer.
Under dissekeringsmikroskopet, trim spissene på håndtrekkede kapillærene med tang. Gjør de to spissåpningsstørrelsene omtrent to ganger og en ganger den korte akselengden på C. elegans embryoer for henholdsvis embryooverføring og eggeskallfjerning.
Fest den trukket kapillæren i et munnpipetteringsapparat. Pipette 45 mikroliter eggesaltoppløsning på en brønn med en flerbrønnssklie.
Plasser 5 til 10 voksne C. elegans på brønnen. For å få tidlig C. elegans embryoer, kutt voksne i stykker ved å plassere to nåler til høyre og venstre for C. elegans kropp og skyve nålene forbi hverandre.
Pipette 45 mikroliter hypoklorittoppløsning på en brønn ved siden av brønnen som inneholder eggsaltoppløsning, og pipette 45 mikroliter sheltons vekstmedium på de etterfølgende tre brønnene. Overfør encellet stadium og tidlige tocellede embryoer inn i hypokorittløsningen ved munnpipetten med større størrelsesåpning og vent i 40 til 55 sekunder.
Vask embryoene ved å overføre dem til de neste tre brønnene med Sheltons vekstmedium med 1 til 2 sekunder i hver av de to første brønnene.
Deretter piper kontinuerlig med den håndtegnede kapillæren for å skille de tocellede embryonale blastomerene.
- Etter fjerning av eggeskall, minimer kraften i pipettering av embryoer opp og ned for å forhindre utbrudd.
