Saggio di locomozione larvale: metodo ad alto contenuto di produttività per studiare la tossicità neurocomportamentale di un composto nelle larve di zebrafish

- Per cominciare, far crescere gli embrioni in 3 piastre di Petri. La prima è una piastra di controllo che contiene la soluzione di Hank, una soluzione salina equilibrata. La seconda e la terza piastra hanno la soluzione di Hank con un composto potenzialmente neurotossico a diverse concentrazioni.

Il composto neurotossico nella soluzione di esposizione penetra nella membrana esterna degli embrioni mediante diffusione passiva e altera i processi del sistema nervoso come l'attenzione, la coordinazione e l'attività muscolare. Una volta che gli embrioni si sviluppano in larve dell'età appropriata, trasferire ogni larva in un pozzo individuale di una piastra di 48 pozzi. Tenere traccia delle condizioni di trattamento per ogni animale.

Trasferire la piastra del pozzo su una piattaforma di registrazione e tirare giù il coperchio. Lasciare che le larve si acclimatino per 10 minuti. Impostare cicli alternati di periodi di luce e buio utilizzando il software.

Le larve di zebrafish normalmente mostrano più movimento al buio e meno movimento nella luce. Registrare la distanza totale percorsa dalle larve del controllo e dai gruppi di esposizione in ogni periodo. Se il composto è neurotossico, le larve mostrano ancora più movimento al buio e alla luce rispetto agli animali di controllo.

Nel seguente protocollo, eseguiremo test comportamentali sulle larve di zebrafish esposte a composti neurotossici.

- Almeno 2 ore prima di eseguire un esperimento, impostare la temperatura ambiente a 28 gradi Celsius e aggiungere 800 microlitri di soluzione di esposizione a ciascun pozzo di una micropiatta da 48 pozzetti. Utilizzare quindi una pipetta da 1 millilitro con una punta modificata per trasferire una larva in 200 microlitri di soluzione di esposizione a ciascun pozzo della micropiatta, in preparazione di un esperimento di locomozione e angolo del percorso.

Una volta impostati tutti i parametri, abbassare l'illuminazione nella sala prove e consentire alle larve di acclimatarsi nel sistema per 10 minuti. Al termine del periodo di acclimatazione, fate clic su Esperimento (Experiment) ed Esegui (Execute) e create la cartella in cui devono essere salvati i file sperimentali. Immettere quindi il nome del risultato e fare clic su Sfondo e inizio.

Al termine dell'esperimento, fate clic su Esperimento (Experiment) e Interrompi (Stop), quindi restituite la micropiatta di pozzo 48 all'incubatore di luce per gli esperimenti successivi.