Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

תגובות קשירת DNA

Overview

בביולוגיה מולקולרית, קשירה מתייחסת לצירוף של שני שברי DNA באמצעות היווצרות של קשר זרחן. אנזים המכונה ליגאז מזרז את תגובת קשירה. בתא, רצועות לתקן הפסקות גדיל יחיד וכפול המתרחשות במהלך שכפול DNA. במעבדה, קשירת DNA משמשת במהלך שיבוט מולקולרי כדי להצטרף לרסיסי DNA של תוספות עם וקטורים – מולקולות DNA נשאיות שישכפלו שברי מטרה באורגניזמים מארחים.

וידאו זה מספק מבוא לקשירת DNA. העיקרון הבסיסי של קשירה מתואר, כמו גם הליך שלב אחר שלב להגדרת תגובת קשירה כללית. היבטים קריטיים של תגובות קשירה נדונים, כגון כיצד אורך של overhang קצה דביק משפיע על טמפרטורת התגובה וכיצד היחס של הוספת DNA לווקטור צריך להיות מותאם כדי למנוע קשירה עצמית. כלים מולקולריים המסייעים עם קשירות כמו שבר Klenow ו פוספטאז אלקליין שרימפס (SAP) מוזכרים, ויישומים , כגון קשירת קרבה ותוספת של קישורים לרסיסים לרצף מוצגים גם.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קשירה יכולה להיות מוגדרת כפעולת הצטרפות, וביולוגיה המונח מתייחס לתגובה אנזימטית המצטרפת לשני ביומולקולות עם קשר קוולנטי. וידאו זה מתאר את היישום של קשירת DNA במחקר ביולוגיה מולקולרית.

בתא, רצועות DNA הן אנזימים המזהים וחותמים הפסקות בדנ"א על ידי זירוז היווצרות קשרים פוספודיסטר בין קבוצות 3 '-הידרוקסיל ו 5 '-פוספט של עמוד השדרה של ה- DNA. קשירה מתרחשת כחלק מתהליכים תאיים רגילים, כגון שכפול DNA, כדי לתקן הפסקות DNA יחיד וכפול גדיל.

במעבדה, רצועות DNA משמשות באופן שגרתי בשיבוט מולקולרי - תהליך המצטרף לרסיסי DNA מתעכלים אנדונוקלאז, או מוסיף, עם וקטור מתעכל אנדונוקלאז, כגון plasmid, כך שבר יכול להיות הציג לתוך תאים מארחים ולאחר מכן משוכפל.

עיכול אנדונוקלאז כרוך בשימוש אנדונוקלאזים הגבלה, או אנזימי הגבלה, אשר יוצרים חתכים במתיחות ספציפיות של DNA.

חתכים אלה יכולים להידמות הפסקות גדיל יחיד לייצר 3 'ו 5 'overhangs, המכונה קצוות דביקים או הפסקות גדיל כפול ללא overhangs, המכונה קצוות קהים. קשירת קצוות דביקים היא יתרון, כי זוגות בסיס overhanging חינם לייצב את התגובה. מכיוון שלקשירת קצה בוטה אין זיווג בסיס חינם, הקשר פחות יעיל וקשה יותר לאנזים להצטרף לקצוות. קצוות דביקים ובוטים לא יכולים, בנסיבות רגילות, להיות קשירה יחד.

עם זאת, שבר Klenow, המוצר של DNA פולימראז 1, מתעכל עם subtilisin יכול להמיר קצוות דביקים לקצוות קהים. לקלנאו יש פעילות אקסונקלאז של 3 עד 5', שלועסת 3' אוברהנג ופעילות פולימראז שמקהה 5'אוברהאנגים על ידי הארכת הקצה ה-3 של הגדיל המשלים.

כאשר המטרה היא להכניס גן לתוך plasmid, פירוק מחדש של DNA וקטורי, הנקרא קשירה עצמית, היא תוצאה בלתי רצויה נפוצה עבור תגובת קשירה. טיפול פוספטאז אלקליין של DNA וקטורי לאחר העיכול מסיר 5'פוספטים בשני הקצוות ומונע תוצאה בלתי רצויה זו.

כפי שציינו קודם לכן, DNAs וקטור ולהכניס מתעכלים עם אנדונקולאזים לפני תחילת קשירה. לאחר טיהור ג'ל של וקטור מזוכל ולהוספה, ריכוזי DNA נמדדים ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את הריכוז של הווקטור המטוהר ולהוסיף.

מריכוז זה, ניתן לקבוע את מספר המולקולות של הכנס או וקטור ב- 1 מיקרול בהתבסס על המשקל המולקולרי הממוצע עבור זוג בסיס DNA ומספר זוגות הבסיס בכל שבר. בהתבסס על הריכוז המולקולרי המחושב של וקטור והכנסה, מחושב יחס של 3 ל-1 של הוספה לווקטור, כדי לקבוע את נפח הווקטור וההוספה המשמשים בתגובה. יחס זה של 3 ל-1 של הכנסת DNA לווקטור הוא רצוי, מכיוון שהוא מעלה את ההסתברות שההוספה נקשרת לווקטור לעומת וקטור המקשר את עצמו.

כעת, לאחר שקבענו את כמות הווקטור והכנסנו דנ"א לשימוש בתגובה, אנו ממשיכים להגדיר את תגובת קשירה על קרח. סדר ההוספה של רכיבי תגובה יש להוסיף לצינור microfuge שלך הוא כדלקמן: מים סטריליים מספיק כדי להפוך נפח סופי 10 μl, במקרה שלנו נשתמש 4 μl, 1 μl 10X של חיץ קשירה, 1 μl 10mm של ATP, 1 μl של וקטור ו 3 μl להכניס DNA, כפי שחושב, ולבסוף 1 μl DNA ליגאז. התגובה מעורבת ביסודיות, צנטריפוגות ודגורה בטמפרטורה המתאימה.

בין אם אתה עושה קשירת קצה דביקה או בוטה משפיעה על הטמפרטורה ומשך תגובת הקשירה. לדוגמה, קשירת קצה דביקה עם זוג בסיסים יכולה להתבצע ליד טמפרטורת החדר במשך כשעה, מכיוון שהקצוות המשלימים מייצבים את צירוף השברים. overhangs קצר או קשירת קצה קהה צריך להתבצע בין 14-20 מעלות צלזיוס לילה.

עכשיו כשלמדנו איך להגדיר תגובת קשירה, בואו נסתכל על כמה מהיישומים של ההליך הזה.

ניתן להשתמש קשירות כדי להכניס שברים מוגברים PCR ישירות לתוך plasmids ליניארי. כאן אתה רואה חוקר לוקח דגימה של מוח עכבר קפוא, מבודד DNA גנומי ממנו, ולאחר מכן חשוף אותו PCR bisulfite, שהיא שיטה מבוססת PCR כדי לזהות DNA מתילאט. מוצרי PCR נקשרים ישירות לפלסמיד כדי ליצור ספרייה של גנים המתילים באזור המוח המסוים הזה.

ניתן להשתמש קשירות כדי לצרף מקשרי אוליגונוקלאוטיד, המכילים אתרי כריכה עבור פריימרים PCR, כדי לטהר שברי DNA. כאשר עובדים עם דגימות גידול, מדענים יכולים להשתמש בגישה זו כדי לרצף DNA גנומי של הגידול, בתקווה לזהות מוטציות הגורמות לגידול.

בסרטון זה, קשירה מבוצעת על DNA מבודד תאים קבועים פורמלדהיד ולאחר מכן מטופל עם אנזים הגבלה klenow בנוכחות ביוטין, אשר משמש לאחר מכן כדי למשוך את ה- DNA קשירה. DNA זה מוגבר לאחר מכן באמצעות PCR ואת המוצרים רצפים כדי לזהות אינטראקציות כרומטין בקנה מידה שונים כפי שמוצג.

עכשיו למדת על קשירת DNA, עקרונות שונים המעורבים בהקמת קשירה במעבדה, בעיות ותיקונים פוטנציאליים ויישומים שונים של קשירה במחקר ביולוגיה מולקולרית. תודה שצפיתם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter