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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Reações de Ligação de DNA

Overview

Na biologia molecular, a ligadura refere-se à junção de dois fragmentos de DNA através da formação de uma ligação fosfodiester. Uma enzima conhecida como ligase catalisa a reação de ligadura. Na célula, as ligass reparam quebras de fios simples e duplos que ocorrem durante a replicação do DNA. Em laboratório, a liga ligase de DNA é usada durante a clonagem molecular para unir fragmentos de DNA de inserções com vetores – moléculas de DNA portadoras que replicarão fragmentos-alvo em organismos hospedeiros.

Este vídeo fornece uma introdução à ligadura de DNA. O princípio básico da ligadura é descrito, bem como um procedimento passo a passo para a criação de uma reação generalizada de ligadura. Aspectos críticos das reações de ligadura são discutidos, como como o comprimento de uma saliência final pegajosa afeta a temperatura de reação e como a razão de inserção de DNA para vetor deve ser adaptada para evitar a autoconteção. Ferramentas moleculares que auxiliam em ligaduras como o Fragmento de Klenow e o linfosfate alcalino de camarão (SAP) são mencionadas, e também são apresentadas aplicações, como ligaduras de proximidade e a adição de linkers a fragmentos para sequenciamento.

Procedure

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A ligadura pode ser definida como o ato de adesão, e na biologia o termo refere-se a uma reação enzimática que une duas biomoléculas com um vínculo covalente. Este vídeo descreve a aplicação da ligadura de DNA em pesquisas de biologia molecular.

Na célula, ligass de DNA são enzimas que identificam e selam quebras no DNA catalisando a formação de ligações fosfodiester entre os grupos de 3'-hidroxil e 5'-fosfato da espinha dorsal do DNA. A ligadura ocorre como parte de processos celulares normais, como a replicação de DNA, para reparar quebras de DNA de fios únicos e duplos.

Em laboratório, as ligass de DNA são rotineiramente usadas na clonagem molecular - um processo que une fragmentos de DNA digeridos pela endonuclease, ou inserções, com um vetor digerido por endonuclease, como um plasmídeo, para que o fragmento possa ser introduzido em células hospedeiras e depois replicado.

As digestões endonuclease envolvem o uso de endonucleases de restrição, ou enzimas de restrição, que criam cortes em trechos específicos do DNA.

Estes cortes podem se assemelhar a quebras de fios simples produzindo saliências de 3' e 5', chamadas de extremidades pegajosas ou quebras de dois fios sem saliências, chamadas de extremidades cegas. Ligar pontas pegajosas é vantajoso, porque os pares de base suspensas de cortesia estabilizam a reação. Como as ligaduras finais sem cortes não têm nenhum emparelhamento de base complementar, a ligadura é menos eficiente e mais difícil para a enzima se juntar às extremidades. Pontas pegajosas e contundentes não podem, em circunstâncias normais, ser amarradas juntas.

No entanto, o fragmento de Klenow, o produto da polimerase de DNA 1, digerido com subtilisina pode converter extremidades pegajosas em extremidades cegas. Klenow possui atividade exonuclease de 3' a 5' que mastiga saliências de 3' e atividade de polimerase que reduz as saliências de 5's, estendendo a extremidade de 3' do fio complementar.

Quando o objetivo é inserir um gene em um plasmídeo, o resealing do DNA vetorial, chamado de auto-ligaduração, é um resultado comum indesejável para uma reação de ligadura. O tratamento de fosfatese alcalina do DNA vetorial pós-digestão remove fosfatos de 1,50m em ambas as extremidades e previne esse desfecho indesejável.

Como mencionamos anteriormente, os DNAs vetoriais e inseridos são digeridos com endonucleases antes de iniciar uma ligadura. Após a purificação de gel do vetor digerido e da inserção, as concentrações de DNA são medidas como um espectotômetro para determinar a concentração do vetor purificado e inserir.

A partir dessa concentração, o número de moléculas de inserção ou vetor em 1 μl pode ser determinado com base no peso molecular médio de um par de base de DNA e no número de pares de base em cada fragmento. Com base na concentração molecular calculada de vetor e inserção, calcula-se uma razão de 3 a 1 de inserção ao vetor, para determinar o volume de vetor e inserir utilizado na reação. Esta razão de 3 a 1 de inserção de DNA para vetor é desejável, porque aumenta a probabilidade da inserção ser ligada em vetor versus ligante vetorial.

Agora que determinamos a quantidade de vetor e inserimos DNA para usar na reação, passamos a configurar a reação de ligadura no gelo. A ordem de adicionar em que os componentes de reação devem ser adicionados ao seu tubo de microfuge é a seguinte: água estéril suficiente para fazer um volume final de 10 μl, no nosso caso usaremos 4 μl, 1 μl 10X de tampão de ligadura, 1 μl 10mM de ATP, 1 μl de vetor e 3 μl inserir DNA, como calculado, e finalmente 1 μl DNA Ligase. A reação é completamente misturada, centrifugada e incubada na temperatura apropriada.

Se você está fazendo uma ligadura final pegajosa ou contundente impacta a temperatura e a duração da reação de ligadura. Por exemplo, uma ligadura final pegajosa com uma saliência de par de seis bases pode ser realizada perto da temperatura ambiente por cerca de 1 hora, porque as extremidades complementares estabilizam a junção de fragmentos. Saliências curtas ou ligaduras finais contundentes devem ser realizadas entre 14-20°C durante a noite.

Agora que aprendemos a configurar uma reação de ligadura, vamos dar uma olhada em algumas das aplicações deste procedimento.

As ligaduras podem ser usadas para inserir diretamente fragmentos amplificados por PCR em plasmídeos linearizados. Aqui você vê um pesquisador pegando uma amostra do cérebro de camundongo congelado, isolando o DNA genômico dele, e depois submetendo-o ao PCR bisulfita, que é um método baseado em PCR para detectar DNA metilado. Os produtos PCR são então diretamente ligados ao plasmídeo para criar uma biblioteca de genes que são metilados nessa determinada região cerebral.

Ligaduras podem ser usadas para anexar linkers oligonucleotídeos, que contêm locais de ligação para primers PCR, para purificar fragmentos de DNA. Ao trabalhar com amostras de tumores, os cientistas podem usar essa abordagem para sequenciar o DNA genômico do tumor, com a esperança de identificar mutações causadoras de tumores.

Neste vídeo, a ligadura é realizada no DNA isolado de células fixas de formaldeído e posteriormente tratada com uma enzima de restrição e klenow na presença de biotina, que é então usada para puxar o DNA ligado. Este DNA é então amplificado usando PCR e os produtos sequenciados para identificar interações de cromatina em várias escalas, como mostrado.

Você já aprendeu sobre ligase de DNA, vários princípios envolvidos na criação de ligaduras em laboratório, potenciais problemas e correções e várias aplicações de ligadura em pesquisa de biologia molecular. Obrigado por assistir.

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Disclosures

Nenhum conflito de interesses declarado.

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