בידוד חומצות גרעין מ שמרים

היום אנחנו נראה לכם איך לטהר חומצות גרעין מ Saccharomyces cerevisiae, הידוע גם בשם שמרי אופה. חומצות גרעין יכולות לכלול DNA או RNA. וידאו זה ידון בבידוד של מולקולות אלה מתאי שמרים על ידי הפרדת פאזה וכרומטוגרפיה.

למרות שקיימות שיטות רבות ושונות לטיהור חומצות גרעין מפני שמרים, רובם חולקים את אותם שלבים ראשוניים.

תאי שמרים מופצים תחילה על ידי בחירת מושבה אחת מצלחת וחסן למדיית YPD. התערובת צריכה להיות גדלה לילה ב 30 °C (50 °F) אינקובטור רועד או מסתובב.

תאי שמרים צריך להיות נקטף בשלב אמצע יומן של צמיחה כדי לייעל את התשואה. שמרים בשלב היומן של הצמיחה יהיה בדרך כלל צפיפות אופטית או "OD" ערך של 0.5-1 כאשר נמדד באורך גל של 600 ננומטר. לאחר שהתאים הגיעו לצפיפות האופטית המתאימה, הם צנטריפוגות ליצירת גלולה, ומנותנות מחדש במאגר תמוז כך שהתאים נשברים.

אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של בידוד חומצות גרעין מפני שמרים הוא שיבוש קירות התא הקשוחים שלה. קירות תא ניתן להרוס עם שילוב של טכניקות אנזימטיות ופיזיות. ההרס של דופן התא גורם שמרים ליצור תאים כדוריים הנקראים spheroplasts שניתן lysed באמצעות טכניקות תמוגה תא סטנדרטיות.

Spheroplasts הם בדרך כלל lysed עם חומרי ניקוי כימיים כגון נתרן דודציל סולפט או SDS, אשר ליזה ממברנות הסלולר. תאים יכולים גם להיות הומוגניים. לדוגמה, חרוזי זכוכית ניתן להוסיף לתאים ותאים הומוגניים על ידי מערבולת. או קירות התא יכול להיות שיבש עם צליל בתדר גבוה במיוחד, באמצעות sonicator, כדי לסייע בתהליך תמהה.

כפי שהוזכר כל הליכי טיהור חומצת גרעין נעשה שמרים יהיו צעדים דומים להתבגרות, קציר, lysing תאי שמרים, אולם ברגע תאים הם lysed, מספר שיטות שונות ניתן להשתמש כדי לבודד חומצות גרעין. חומצות גרעין ניתן לטהר באמצעות כריכת עמודה או הפרדת פאזה.

DNA ורנ"א מבודדים ביותר באמצעות כריכת עמוד סיליקה. חומצות גרעין ייקשרו לעמודה באמצעות החלפת אניון וניתן לברוח מהעמודה לאחר שהופרדו מרכיבים תאיים אחרים.

הפרדת פאזה משתמשת בעיקרון כי פתרונות עם תכונות שונות יכולים לשמש כדי לטהר או לרכז חלבונים מסוימים או חומצות גרעין המבוססות על המסיסות שלהם. התוספת של כלורופורם מבדילה ריר של רכיבי תאים לשני שלבים שונים, מימי ואורגני. השלב האורגני מכיל חלבונים ואילו שלב האקווה מכיל חומצות גרעין. לאחר מכן ניתן לזרז את הדנ"א מהשלב האורגני בתוספת אתנול.

חומצות גרעין ניתן לבודד מן שמרים באמצעות פרוטוקול איגוד עמודה. ראשית, תאים גדלים ונקצרים על ידי צנטריפוגה.

הסופר-נט מוסר ונזרק בזמן שכדור התא נמצא מחדש במאגר המכיל אנזימים, מערבולת ודגרה עד שדפנות התא מתעכלות. עיכול דופן התא ויצירת spheroplast ניתן לאמת עם מיקרוסקופיה בעת אופטימיזציה טיפול באנזים. לאחר עיכול דופן התא, מאגר תמוגה מתווסף לתאים והתערובת מערבולת.

יש לצנטריפוג את התאים המלקטים כדי להבהיר את תערובת הפסולת, ומשאירים DNA וחלקיקים קטנים וחלבונים מסיסים בסופרנט. Supernatant הוא טעון על עמוד סיליקה וחומצות גרעין מותר לאחר מכן לאגד לאחר צנטריפוגה, אשר יסיר חלק גדול של זיהומים מסיסים.

שלבי הכביסה מבוצעים עם אתנול או חיץ מלח גבוה כדי להסיר זיהומים שיורית מחומצות הגרעין הכרואות. לבסוף, ה- DNA או ה- RNA הוא eluted עם מים או חוצץ נמוך במלח. הקפד להשתמש חוצץ או מים כי הוא ללא אנזימים DNAse ו RNAse.

חומצות גרעין מבודדות משמרים יש מגוון רחב של שימושים בהתאם למטרה הניסיונית הספציפית שלך. DNA מבודד שמרים יכול לשמש עבור מספר טכניקות ביולוגיה מולקולרית שונות כולל: PCR, סופג דרומי, או הגבלת עיכול אנזים.

שינויים בביטוי הגנים יכולים להיות מזוהים על ידי תהליך המכונה ניתוח microarray, המשתמש במערכי גנים כמו זה.

אם יש לנו שתי תרביות שמרים, אחת חשופה למי חמצן ואחת לשליטה, ניתן לבודד את mRNA מתרביות אלה ולהכלא על שקופיות מיקרו-עראי. השקופיות מנותחות וניתן לזהות את הגנים שמשתנים על ידי עקה חמצונית.

בסרטון זה, החוקרים עושים שימוש במערכת רובוטית כדי להכין ספרייה של מוטציות שמרים ברחבי הגנום, המשמשות להערכת תפקוד הגנים. בשל החדרת רצפים מהונדסים במיוחד, הנקראים ברקודים גנטיים, לגנים דנ"א גנומי מזני מוטציה ניתן לחלץ מ 4,000 ל 6,000 אנשים בו זמנית וחשף ניתוח microarray או רצף. בהתבסס על השפע היחסי של רצפי הברקוד, הכושר, של כל מוטציה יכול להיקבע בתנאים ניסיוניים מרובים.

הרגע צפית בסרטון של JoVE על בידוד חומצות גרעין משמרים. עכשיו אתה צריך להבין את ההיבטים הבסיסיים של טיהור חומצות גרעין כגון כיצד להכין תאי שמרים עבור תמוגה וכיצד לבצע הליכי מיצוי ובידוד שונים. כמו תמיד, תודה שצפית!