Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

 
Click here for the English version

Isolare gli acidi nucleici dal lievito

Overview

Uno dei molti vantaggi dell'utilizzo del lievito come sistema modello è che grandi quantità di biomacromolecole, compresi gli acidi nucleici (DNA e RNA), possono essere purificate dalle cellule coltivate.

Questo video affronterà i passaggi necessari per eseguire l'estrazione dell'acido nucleico. Inizieremo delineando brevemente la crescita e la raccolta e la lisi delle cellule di lievito, che sono i primi passi comuni all'isolamento di tutte le biomacromolecole. Successivamente, discuteremo due metodi di purificazione unici per la separazione degli acidi nucleici: legame della colonna e separazione di fase. Inoltre, dimostreremo diversi modi in cui questi metodi vengono applicati in laboratorio, tra cui la preparazione di acidi nucleici per tecniche di biologia molecolare come PCR e southern blotting, quantificazione dell'espressione genica in risposta a stimoli ambientali e purificazione di grandi quantità di proteine ricombinanti.

Procedure

Oggi ti mostreremo come purificare gli acidi nucleici da Saccharomyces cerevisiae, noto anche come lievito di birra. Gli acidi nucleici possono includere DNA o RNA. Questo video discuterà l'isolamento di queste molecole dalle cellule di lievito mediante separazione di fase e cromatografia.

Sebbene esistano molti metodi diversi per purificare gli acidi nucleici dal lievito, la maggior parte di essi condivide gli stessi passaggi iniziali.

Le cellule di lievito vengono prima propagate selezionando una singola colonia da una piastra e inoculando in mezzi YPD. La miscela deve essere coltivata durante la notte a 30 °C in un'incubatrice vibrante o rotante.

Le cellule di lievito dovrebbero essere raccolte nella fase intermedia della crescita per ottimizzare la resa. Il lievito nella fase logaritrica della crescita di solito ha una densità ottica o un valore "OD" di 0,5-1 se misurato a una lunghezza d'onda di 600 nm. Una volta che le cellule hanno raggiunto la densità ottica appropriata, vengono centrifugate per formare un pellet e riconsocie in un tampone di lisi in modo che le cellule si rompono.

Uno degli aspetti più impegnativi dell'isolamento degli acidi nucleici dal lievito è l'interruzione delle sue pareti cellulari dure. Le pareti cellulari possono essere distrutte con una combinazione di tecniche enzimatiche e fisiche. La distruzione della parete cellulare fa sì che il lievito formi cellule sferoidi chiamate sferoplasti che possono essere lizzate tramite tecniche standard di lisi cellulare.

Gli sferoplasti sono tipicamente lisati con detergenti chimici come il solfato di sodio dodecile o SDS, che lyse le membrane cellulari. Le cellule possono anche essere omogeneizzate. Ad esempio, le perle di vetro possono essere aggiunte alle cellule e le cellule omogeneizzate mediante vortice. Oppure le pareti cellulari possono essere interrotte con un suono ad altissima frequenza, utilizzando un sonicatore, per aiutare nel processo di lisi.

Come accennato, tutte le procedure di purificazione degli acidi nucleici eseguite nel lievito avranno passaggi simili per la crescita, la raccolta e la lisi delle cellule di lievito, tuttavia una volta che le cellule sono state lizzate, è possibile utilizzare diversi metodi per isolare gli acidi nucleici. Gli acidi nucleici possono essere purificati attraverso il legame della colonna o la separazione di fase.

Il DNA e l'RNA sono meglio isolati usando il legame della colonna di silice. Gli acidi nucleici si legano alla colonna attraverso lo scambio anionico e possono essere eluiti dalla colonna una volta separati da altri componenti cellulari.

La separazione di fase utilizza il principio secondo cui soluzioni con proprietà diverse possono essere utilizzate per purificare o concentrare determinate proteine o acidi nucleici in base alla loro solubilità. L'aggiunta di cloroformio differenzia un impasto di componenti cellulari in due diverse fasi, quella acquosa e quella organica. La fase organica contiene proteine mentre la fase aqueos contiene acidi nucleici. Il DNA può quindi essere precipitato dalla fase organica con l'aggiunta di etanolo.

Gli acidi nucleici possono essere isolati dal lievito utilizzando un protocollo di legame a colonna. In primo luogo, le cellule vengono coltivate e raccolte mediante centrifugazione.

Il surnatante viene rimosso e scartato mentre il pellet cellulare viene risussoso in un tampone contenente enzimi, vorticoso e incubato fino a quando le pareti cellulari non vengono digerite. La digestione della parete cellulare e la formazione di sferoplasti possono essere verificate con la microscopia quando si ottimizza il trattamento enzimatico. Dopo la digestione della parete cellulare, il tampone di lisi viene aggiunto alle cellule e la miscela viene vorticosa.

Le cellule lizzate devono essere centrifugate per chiarire la miscela di detriti, lasciando DNA e piccoli particolati e proteine solubili nel surnatante. Il surnatante viene caricato su una colonna di silice e gli acidi nucleici vengono quindi lasciati legare dopo la centrifugazione, che rimuoverà una massa delle impurità solubili.

Le fasi di lavaggio vengono eseguite con etanolo o tampone ad alto contenuto salino per rimuovere le impurità residue dagli acidi nucleici legati. Infine, il DNA o l'RNA viene eluito con acqua o un tampone a basso contenuto di sale. Assicurati di utilizzare un tampone o acqua priva degli enzimi DNAse e RNAse.

Gli acidi nucleici isolati dal lievito hanno una varietà di usi a seconda del tuo specifico obiettivo sperimentale. Il DNA isolato dal lievito può essere utilizzato per una serie di diverse tecniche di biologia molecolare tra cui: PCR, southern blotting o digestione enzimatica di restrizione.

I cambiamenti nell'espressione genica possono essere identificati da un processo noto come analisi microarray, che utilizza array di geni come questo.

Se abbiamo due colture di lievito, una esposta al perossido di idrogeno e una di controllo, l'mRNA può essere isolato da queste colture e ibridato su vetrini di microarray. I vetrini vengono analizzati e i geni che vengono modificati dallo stress ossidativo possono essere identificati.

In questo video, i ricercatori fanno uso di un sistema robotico per preparare una libreria di mutanti di lievito a livello di genoma, che vengono utilizzati per valutare la funzione genica. A causa dell'inserimento di sequenze specificamente ingegnerizzate, chiamate codici a barre genetici, nei geni il DNA genomico da ceppi mutanti può essere estratto da 4.000 a 6.000 individui contemporaneamente e sottoposto ad analisi o sequenziamento di microarray. Sulla base dell'abbondanza relativa delle sequenze di codici a barre, la forma fisica di ciascun mutante può essere determinata in più condizioni sperimentali.

Hai appena visto il video di JoVE sull'isolamento degli acidi nucleici dal lievito. Ora dovresti capire gli aspetti di base della purificazione degli acidi nucleici come preparare le cellule di lievito per la lisi e come eseguire diverse procedure di estrazione e isolamento. Come sempre, grazie per aver guardato!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Tags

Valore vuoto Problema
Waiting X
Simple Hit Counter