Mere end halvdelen af proteiner er små proteiner (molekylvægt <200 kDa), der er udfordrende for både elektronmikroskop billedbehandling og tredimensionale rekonstruktioner. Optimeret negativ farvning er en robust og high-throughput-protokollen til at opnå en høj kontrast og relativt høj opløsning (~ 1 nm) billeder af små asymmetriske proteiner eller komplekser under forskellige fysiologiske betingelser.