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일차 신경 세포 배양

Overview

뇌의 복잡성은 종종 실험 조작 및 관찰을위해 더 간단한 시스템을 사용하는 신경 과학자를 필요로한다. 한 가지 강력한 접근법은 신경계 조직을 해부하고 단일 세포로 해리하고 체외에서세포를 성장시킴으로써 1 차 문화를 생성하는 것입니다. 1 차적인 문화는 신경세포와 glia를 유전 조작 및 시간 경과 화상 진찰 같이 기술에 필요한 실험 공구에 쉽게 접근할 수 있게 합니다. 더욱이, 이러한 배양은 세포 세포 상호 작용과 같은 복잡한 현상을 연구하는 고도의 통제 가능한 환경을 나타낸다.

이 비디오는 관심 있는 조직을 선택하고 해부하는 것을 포함하는 1 차적인 신경 배양을 생성하는 주요 단계의 개요를 제공합니다, 기계적으로 그리고 화학적으로 단일 세포 현탁액을 생성하기 위하여 조직을 분해하고, 세포를 도금하고, 적당한 매체에 있는 배양을 유지합니다. 몇몇 보기 실험은 또한 살아있는 뉴런에 있는 단백질 인신 매매, 형태학 변경 및 전기 생리학을 조사하기 위하여 배양된 세포가 어떻게 이용될 수 있는지 보여주기 위하여 제시됩니다.

Procedure

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뇌는 신체에서 가장 복잡한 기관 중 하나이므로 신경 과학자들은 종종 실험 적 조작 및 관찰을위한 간단한 시스템이 필요합니다. 세포 배양은 살아있는 뉴런에 쉽게 접근할 수 있는 시스템 중 하나입니다. 일반적으로, 배양 세포는 멸균, 제어 가능한 환경 - 일반적으로 따뜻한 인큐베이터 내에서 배양 매체에게 불린 특별한 해결책에서 그(것)들을 증가시키는 관련시킵니다. 1 차적인 문화는 유기체에서 해부된 조직에서 생성되는 것입니다. 1 차적인 신경 문화의 다른 모형은 동물의 각종, 발달 단계 및 신경계 조직에서 만들 수 있습니다.

이 비디오는 일반적으로 이 세포를 사용하는 1 차적인 신경 배양 및 실험의 몇몇을 생성하는 방법에 소개를 제공할 것입니다.

신경 과학 연구에 중요 한 동물 모델의 많은 기본 신경 문화를 준비 하는 데 사용할 수 있습니다. 생의학 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 포유류 중 두 마리인 마우스와 쥐를 사용하면 배아, 신생아 새끼 및 성인이 배양을 위해 해부될 수 있습니다. 태아와 주산기 새끼는 뇌 세포가 미숙하고 손상에 덜 취약하기 때문에 일반적으로 선호됩니다.

다양 한 신 경계 조직 격리 하 고 기본 신경 문화의 다른 종류를 생산 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 뇌의 특정 부분은 소뇌, 피질 및 해마와 같은 해부 될 수 있습니다. 등대 뿌리 신경과 같은 말초 신경계의 척수 또는 구성 요소는 특정 유형의 뉴런을 성장시키기 위해 해부되고 배양될 수 있습니다.

조직 원에 관계없이, 1 차적인 신경 배양을 생성하는 일반적인 방법은 몇 가지 주요 단계로 요약 될 수있다: 해부, 해실, 도금, 및 유지 보수.

첫 번째 단계인 해부로 이러한 단계에 대한 심층 검토를 시작해 보겠습니다. 해부 및 배양 단계를 준비하는 과정에서 배양이 오염되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 공구는 알코올로 살균되어야 하며, 라미나르 플로우 후드는 종종 공기 중 오염 물질을 제거하는 데 사용됩니다.

설치류 뉴런을 배양하기 위해, 조직은 차갑고 완충된 소금 용액으로 갓 안락사된 동물에서 제거되어야 합니다. 해부 현미경을 사용하여, 조직의 작은 부분 - 해마와 같은 - 추가 처리를 위해 주의 깊게 격리될 수 있습니다.

다음으로, 해리라고 하는 프로세스에서 샘플을 셀룰러 구성 요소로 분해할 필요가 있습니다. 해부 된 조직은 메스 또는 가위를 사용하여 먼저 다진다. 결과 조직 조각은 다음 새로운 용기로 전송됩니다. 트립신 이나 papain 와 같은 프로테오리틱 효소는 세포를 함께 결합하는 세포 외 매트릭스 단백질을 소화하기 위해 첨가됩니다. 따뜻한 인큐베이터 나 수조에서 짧은 인큐베이션에 이어, 조직 조각은 부드럽게 효소를 제거하기 위해 버퍼로 세척됩니다.

연화 된 조직 조각은 이제 세포가 단일 세포 현탁액으로 풀려날 수 있도록 파이프를 여러 번 통해 조직을 통과하는 것을 포함하는 삼각에 의해 해리 될 수 있습니다. 이 시점에서, 세포는 농도계산하고 Trypan blue와 같은 얼룩을 사용하여 생존가능성을 검사할 수 있으며, 이는 성공적인 성장을 위해 현탁액을 희석해야 하는 양을 결정하는 데 도움이 됩니다.

마침내, 뉴런은 문화에 대한 준비가되어 있습니다! 살아 있고 건강하게 유지하기 위해 취해야 할 몇 가지 중요한 조치를 검토해 보겠습니다. 뉴런을 성장시키는 데 사용되는 배양 매체의 구성은 매우 중요합니다. 신경 생존과 성장을 지원하는 특별한 보충제는 일반적으로 미디어에 추가됩니다. 다른 첨가제는 신경교 세포와 같은 비 신경 세포의 분열을 억제하는 약물을 포함할 수 있다.

신경 세포 현탁액이 미디어와 혼합된 후, 세포는 원하는 용기에서 도금될 준비가 되어 있다. 여기에는 문화 접시와 접시 또는 유리 커버립이 이러한 용기 안에 배치되어 포함될 수 있습니다. 뉴런은 유리에서 직접 성장할 수 없기 때문에 커버립은 세포 부착 및 성장을 위한 더 나은 표면을 만들기 위해 미리 처리됩니다. 이러한 치료는 합성 세포 외 매트릭스 단백질코팅을 포함할 수 있습니다. 예를 들어, 폴리 리신 및 라미닌; 또는 표면을 거칠게 하는 산 에칭.

일단 도금되면, 뉴런은 따뜻하고 가습된 인큐베이터 내부에서 재배됩니다. 신경 과정의 성장은 몇 시간에서 일 안에 관찰 될 수있다. 문화를 유지하기 위해 문화 미디어의 일부는 일주일에 한 번 정도 신선한 미디어로 대체됩니다. 전형적으로, 1 차적인 신경 배양은 도금 후에 며칠에서 5 주에 어디에서든지 실험에 이용됩니다.

이제 배양에서 성장하는 뉴런이 생겼으니, 이 세포로 무엇을 할 수 있을까요?

일반적으로 신경 배양에 적용 되는 한 가지 기본 방법은 트랜스 페이션 또는 바이러스 성 트랜스 포에 의해 유전 조작. 유전 물질 인코딩, 예를 들어, 돌연변이 단백질은, 신경 기능을 바꾸기 위하여 배양된 뉴런으로 소개될 수 있다. 대안적으로, 이중 좌초 RNA를 가진 형질은 단백질 발현을 차단하는 효과적인 기술이다. 유전 조작을 위한 다중 방법 및 시약의 가용성은 이것을 연구 질문의 다양한 특히 귀중한 응용 프로그램합니다.

신경 배양에 있는 전염으로 해결될 수 있는 예시 질문은: 특정 단백질 또는 단백질 복합체가 뉴런의 각종 형태학적 구조에 인신매매되는 방법과 어디에 있습니까? 해답을 얻으려면 뉴런은 관심있는 단백질을 코딩하는 DNA로 전감염되며, 이는 녹색 형광 단백질 또는 GFP와 같은 형광 단백질과 융합 될 수 있습니다. 형광 태그 단백질의 운동 패턴 및 국소화는 살아있는 화상 진찰로 그 때 감시될 수 있습니다. 이 방법은 예를 들어, 세포 표면에 신경 전달 물질 수용체의 인신 매매를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

1 차적인 신경 배양은 또한 단하나 세포의 전기 활동이 마이크로 전극을 사용하여 측정될 수 있는 전기 생리학 연구 결과에 매우 유용합니다. 배양에 있는 뉴런의 단하나 층은 개별 세포가 표적으로 하기 쉽다는 것을 의미하고, 약리학적 인 처리와 같은 조작은 신속하고 균등하게 적용됩니다. 예를 들어, 단일 뉴런의 활동에 대한 테스트 화합물의 효과는 배양 된 뉴런의 패치 클램프 기술로 측정 될 수있다.

당신은 방금 주요 신경 문화에 대한 JoVE의 소개를 지켜보았습니다. 이 비디오에서는 이러한 문화권이 어떻게 준비되어 있는지, 그리고 일반적으로 사용되는 실험 유형을 시연했습니다. 1 차적인 신경 배양은 전형적으로 해부를 관련시키는 방법을 사용하여, 세포 현탁액으로 해조하고, 인큐베이터에서 배양 매체에서 성장하는 다양한 조직 근원에서 만들어질 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

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