Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

신경 트랜스펙션 방법

Overview

유전 물질을 세포로 옮기는 과정인 트랜스펙트(Transfection)는 세포에서 유전자 발현을 신속하고 효율적으로 조작하는 강력한 도구입니다. 이 방법은 특정 단백질의 발현을 침묵하거나 외래 또는 변형 된 단백질의 발현을 구동하는 데 사용할 수 있기 때문에, 형질은 뉴런 기능을 제어하는 세포 및 분자 과정의 연구에서 매우 유용한 도구이다. 그러나, 성숙한 뉴런은 그(것)들을 transfect 어렵게 만드는 속성의 수를 가지고, 그래서 이 세포 모형의 유전 조작을 위해 특화된 기술이 요구됩니다.

이 비디오는 뉴런을 변형시키는 것의 원리와 근거를 검토합니다. 뉴런 트랜스포션을 위한 3개의 일반적인 전략은 핵혈제, 유전자 총 및 바이러스성 transction를 포함하여 토론됩니다. 각 기술이 뉴런 을 횡단하는 것과 관련된 문제를 극복하는 방법을 설명하는 것 외에도 프레젠테이션에는 세 가지 방법이 모두 수행되는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다. 마지막으로, 뉴런 형태학을 시각화하기 위한 형광 튜룰린 단백질의 발현, 파킨슨병의 세포 배양 모델을 생성하는 선택적 유전자 침묵 과 같은 여러 가지 뉴런 트랜스페션이 도입된다.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

유전 물질을 포유류 세포로 옮기는 트랜스펙트 (Transfection)는 과학자들이 뉴런과 뉴런 조직을 유전적으로 조작 할 수있는 귀중한 도구입니다. 섬세한 세포의 독특한 특성은 트랜스포메이션을 어렵게 만들고 특수 기술을 필요로 합니다.

이 비디오는 뉴런을 변형시키는 뒤에 원리를 검토하고 핵을 포함하여 이 세포에 일반적으로 이용되는 전략을 소개합니다, 생물권 형 질과, 바이러스성 transction. 마지막으로, 우리는 세포 및 분자 신경 과학 연구에서 경질 기술의 응용 프로그램에 대해 논의 할 것입니다.

먼저 트랜스페션의 작동 방식을 검토해 보겠습니다. 유전 물질은 주변 배지에 첨가하여 배양 된 세포에 근접하여 전달 될 수 있지만 뉴클레오티드는 세포 막을 효율적으로 침투 할 수 없습니다.

모든 경질 프로토콜은 유전 물질이 이 장벽을 우회할 수 있도록 설계되었습니다. 침묵 RNA 같이 단백질 생산을 막는 뉴클레오티드는 세포질에 들어가면 즉시 기능을 수행할 수 있습니다. 그러나, DNA 기지를 둔 구조물은 단백질 합성이 시작될 수 있기 전에 번역을 위한 핵으로 수송되어야 합니다.

세포를 나누면, 미토시스 중 핵 봉투의 붕괴는 세포 핵을 개혁하는 것으로 감염된 DNA의 통합을 초래할 수 있다. 대부분의 배양 된 뉴런은 미토틱 후 - 또는 비 분할 - 세포이기 때문에, 유전자 발현을 성공적으로 유도하기 위해 전문화 된 형질 전환 프로토콜이 필요합니다.

핵으로 이러한 프로토콜에 대한 개요를 시작합시다. 이 기술은 유도된 전기장과 화학 시약의 조합을 활용하여 세포와 핵막 모두에서 일시적인 기공과 같은 구조를 만들기 위해 함께 작용합니다. 뉴클레오티드가 충전되기 때문에 전기장은 또한 모공을 통해 DNA의 움직임을 유도합니다.

이 절차를 수행하기 위해, 현탁액의 뉴런은 상업적 인 핵 절제시에 있는 재중단의 앞에 원심분리에 의해 펠릿에서 집합됩니다. 세포 혼합물은 정제 된 DNA와 결합하고 뉴클레오펙터 장치와 전기 접촉을 하는 두 개의 알루미늄 판을 특징으로하는 전기 화 큐벳으로 전달됩니다. 이 장치는 셀 유형에 따라 사용자 정의 된 일련의 빠른 전기 펄스를 제공합니다. 핵포피션 후, 세포는 배양 배지에서 희석되고 지속적인 성장을 위해 도금될 수 있다.

또는, 유전자 총 기술은 세포와 핵막을 통해 유전 물질을 운반하는 총알을 발사하여, 형질 장벽을 통해 폭발한다.

유전자 총 탄환을 만들기 위해 관심 유전자를 인코딩하는 DNA는 일반적으로 금으로 구성된 미크론 규모의 구슬에 침전됩니다. 10분 동안 인큐베이션을 한 후 구슬을 세척하여 튜브로 옮겨 넣습니다. 그런 다음 용액이 건조될 때 튜브가 회전되어 구슬이 균일하게 코팅됩니다. 다음으로 튜브는 카트리지로 절단되어 총으로 로드됩니다. 유전자 탑재하중의 가스 구동 전달은 트리거의 간단한 당김에 의해 표준 배양 판에서 성장하는 세포에서 수행 될 수있다.

마지막으로, 바이러스 성 전달은 핵으로 외국 유전 물질을 전달하기 위해 바이러스 성 수명 주기를 이용합니다. 관심 있는 유전자를 코딩하는 RNA는 특정 막 단백질에 결합하여 표적 세포로 진입하는 렌티바이러스 벡터로 알려진 수정된 레트로바이러스로 포장되어 막 융합 이벤트를 유발한다. 바이러스 RNA는 핵으로 수송되는 상호 보완적인 DNA 가닥으로 전사된 그 때 반전됩니다.

이 절차를 시작하기 전에 바이러스는 신체의 세포뿐만 아니라 요리의 세포를 감염시킬 수 있으므로 안전 지침을 따르는 것이 매우 중요합니다.

첫 번째 단계는 관심있는 유전자를 운반하는 렌즈 바이러스 입자를 생성하는 것입니다. 이것은 293T 세포 같이 바이러스성 생산에 최적화된 인간 세포주에서 바이러스의 빌딩 블록을 표현해서 달성됩니다. 엔지니어링 된 바이러스의 불필요한 확산을 방지하기 위해, 그들의 조립에 필요한 유전자는 전염입자에 포함 되는 전송 벡터에서 별도 유지 됩니다.

완전히 조립된 바이러스가 배양 매체로 방출되는 데 약 2일이 걸리며, 이 곳에서 극심분리에 의해 수집및 농축될 수 있다. 다음으로, 바이러스의 적절한 농도 또는 티터(titer)는 시험 세포주에서 의전 성공사례를 평가함으로써 결정된다. lentiviral 벡터는 그 때 표적 신경 배양에 추가하고 전형적으로 감염이 일어났는지 확인하기 위하여 24 48 시간 동안 배양됩니다.

일반적인 전환 기술에 익숙해지면 사용하는 것은 실험의 특정 목표에 따라 달라집니다. 몇 가지 예를 살펴보겠습니다.

시작하려면, 배양에 있는 뉴런의 성숙을 관찰하는 것은 수지상 척추의 형성같이 신경 연결에 중요한 형태학적 변경의 상세한 분석을 허용합니다. 시간이 지남에 따라 세포 형태학을 시각화하기 위해, 이 연구원은 배양된 뉴런으로 형광 단백질을 전달하기 위하여 핵을 이용했습니다. 여기서, 형광 태그 튜룰린 단백질은 세포의 하위 집합으로 전염되어 형광 현미경 검사를 통해 세포 과정의 상세한 분석을 가능하게 했습니다. 발현 수준은 뉴런의 수명 내내 유지되었기 때문에, 형태학적 분석은 배양에서 적어도 한 달 동안 수행될 수 있었다.

Transfection은 또한 신경 기능에 특정 유전 돌연변이의 충격을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 유전자 총은 단백질의 야생 모형 또는 돌연변이 버전을 코딩하는 DNA를 전달하기 위하여 이용될 수 있고, 세포 생물학에 단기 충격은 신경 발사의 패치 클램프 기록에 의해, 예를 들면 평가될 수 있습니다.

마지막으로, 유전자의 기능을 테스트하기 위한 일반적인 전략은 발현이 막히면 세포에 어떤 일이 일어나는지 관찰하는 것입니다. 이러한 실험의 경우, 렌티바이러스 벡터는 단백질 합성을 방지하는 침묵하는 RNA 구조를 전달하는 데 사용될 수 있다. 이 실험에서, 파킨슨 병과 관련 된 유전자의 녹다운 세포 생존가능성에 상당한 감소로 이어질.

당신은 단지 뉴런의 트랜스퍼에 조브의 소개를 보았다. 이 비디오에서우리는 세 가지 일반적인 트랜스포션 전략에 대한 절차 및 응용 뿐만 아니라 뉴런 트랜스펙션의 원리를 소개했습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter