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Developmental Biology

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Overview

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)는 미분화 줄기 세포를 형성하기 위하여 유전으로 다시 프로그램된 체세포입니다. 배아 줄기 세포와 마찬가지로 iPSC는 다른 세포 유형으로 분화를 촉진하는 배양 조건에서 재배 될 수 있습니다. 따라서, iPSC는 재생 의학의 분야에서 중요한 돌파구인 어떤 인간 적인 세포 모형의 잠재적으로 무제한 근원을 제공할 수 있습니다. 그러나, iPSC의 파생 및 분화에 더 많은 연구는 여전히 실제로 임상 사례에서 이러한 세포를 사용 하 여 필요.

이 비디오는 먼저 세포 재프로그래밍의 기본 원리를 소개한 다음 차별화된 마우스 배아 섬유아세포와 iPSC 생성을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 마지막으로, 과학자들이 iPSC 생성 기술을 개선하거나 적용하는 몇 가지 실험에 대해 논의할 것입니다.

Procedure

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유도 된 만능 줄기 세포, 인간 배아 줄기 세포 처럼, 본문에 거의 모든 세포로 분화 수 있습니다., 따라서 재생 의학 분야에서 큰 약속을 보유.

인간 배아 줄기 세포, 또는 hESC는, 완전히 분화된 체세포가 유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는 데 사용되는 반면, 이식 전 배아로부터 얻어진다.

이 비디오에서는 iPSC 생성의 기본 원칙, 분화 된 셀의 흉부 를 유도하는 단계별 프로토콜 및 이 프로토콜의 많은 다운스트림 응용 프로그램 및 수정에 대해 알아봅니다.

먼저 체세포 유형의 iPSC 생성 뒤에 있는 원리에 대해 논의해 보겠습니다.

피부 세포 나 뉴런과 같은 분화 된 세포는 운명이 결정된 세포입니다. 그들은 특정 기능을 수행하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 다른 한편으로는, 만능 줄기 세포는 그의 운명이 미정인 그들이고, 세포의 어떤 모형으로 분화할 수 있습니다.

이미 분화 된 세포의 정체성을 다능한 상태로 변경하는 과정은 세포 재프로그래밍이라고합니다. 이것은 세포에 의해 생성된 단백질의 수 그리고 모형이 세포의 정체성을 정의하는 중요한 역할을 하기 때문에 세포에 있는 유전자 발현의 패턴을 바꾸는 관련시킵니다.

세포 재프로그래밍을 유도 하는 방법 중 하나는 특정 전사 요인의 발 현을 유도 하 여. 전사 요인은 유전자 내의 조절 서열에 결합하는 단백질입니다. 이러한 서열 중 일부는 "프로모터"라고 불리므로 유전자의 전사를 촉진합니다. 몇몇 전사 요인은 세포 정체성에 큰 충격이 있는 수많은 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다.

흉부를 유도하는 것으로 입증된 4가지 고전적인 전사 요인은 10월4일, Sox2, cMyc 및 Klf4입니다. 이러한 요인은 야마나카 요인으로도 알려져 있습니다.

여러 가지 방법은 이러한 전사 인자의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 가장 일반적이고 효율적인 방법은 유전자에 통합될 핵으로 전사 인자 유전자를 전달하기 위해 수정된 바이러스를 사용하는 것입니다.

이 방법에서, 4개의 야마나카 인자를 코딩하는 유전자는 개별적으로 다른 레트로바이러스로 포장되고 분화된 세포에 추가됩니다. 세포가 수정된 바이러스에 드러나면, 분화된 세포의 작은 분수는 4개의 전사 인자 운반 바이러스 모두에 감염됩니다. 그(것)들은 다능성 줄기 세포의 큰 구형 클러스터가 형성될 때까지 분화하기 시작합니다. 클러스터 형성은 iPSC가 생체 내 줄기 세포와 유사한 미세 환경을 조성하는 데 도움이 되므로 흉부 유지를 돕습니다.

이제 iPSC 생성의 기본 원리를 이해하기 때문에 바이러스 성 트랜스듀션 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEFs에서 자위를 유도하기위한 일반적인 프로토콜을 살펴보겠습니다.

이 절차를 시작하기 전에 바이러스가 신체의 세포를 감염시킬 수 있으므로 안전 지침을 따르는 것이 매우 중요합니다.

배양 배지는 고밀도의 MEF를 포함하는 플레이트에서 제거되고, 세포는 완충액으로 세척된다. 다음으로, 트립신과 같은 단백질 분해 효소를 함유한 용액이 첨가되어 접시 바닥에서 세포를 들어 올립니다. 배양 배지는 플레이트에 첨가되고, 분리된 세포는 원심분리기 튜브로 옮겨져 있다.

원심분리에 따라, 펠릿은 배양 배지에서 다시 중단된다. 다음으로, 세포는 계산되고 농도가 조정되어 최적의 세포 수가 다음날 바이러스에 감염될 수 있도록 한다. 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.

세포가 새로운 접시에 정착한 후, 오래된 매체는 신선한 매체로 대체되고, 원하는 전사 인자를 포함하는 엔지니어링 바이러스가 접시에 추가된다. 세포는 감염이 일어날 수 있도록 충분한 시간 동안 바이러스와 함께 배양됩니다. 잠복 후, 자유 바이러스를 함유하는 배지를 제거하고 신선한 배아 줄기 세포 배지로 대체한다.

변환 후 2-3 주 동안, 세포는 인큐베이터에서 37 °에서 재배되어야하며, 배양 매체는 매일 교체되어야한다.

이 기간 후에, 배아 줄기 세포 식민지와 유사한 iPSC 식민지는 포착될 만큼 충분히 커져야 합니다. 식민지는 적절한 성장 인자를 가진 매체를 포함하는 신선한 판으로 전송될 수 있고, 더 성장할 수 있습니다. 흉부를 확인하기 위해 세포 집단의 일부가 흉부 마커로 얼룩져 있습니다.

이제 분화 된 셀에서 iPSC를 생성하는 방법을 보았으니 이 매우 유용한 메서드의 일부 다운스트림 응용 프로그램 및 수정 사항을 살펴보겠습니다.

iPSC의 중요한 특징은 바디에 있는 거의 모든 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 이 예는 iPSCs에서 심근세포에게 불린 심장 근육 세포의 세대를 보여줍니다. 이를 위해 iPSC는 만능 줄기 세포의 집합인 배아 체를 형성할 수 있도록 하는 비 부착 판으로 옮겨집니다. 배아 체는 혈청과 아스코르브산을 함유한 특수 배지로 배양되어 심장 분화를 향상시킵니다. 일부 세포가 이길 시작할 때 성공적인 분화는 쉽게 관찰 할 수 있습니다.

iPSC는 잠재적으로 어떤 세포 모형으로 분화할 수 있기 때문에, 마우스 같이 전체 유기체를 형성할 수 있습니다. 이 작업은 테트라클로이드 보완이라고 하는 분석서를 사용하여 수행할 수 있습니다. 첫째, 4세트의 염색체를 포함하는 배아인 테트라클로이드 배아는 전기장을 사용하여 초기 배아의 2개의 세포를 융합하여 형성된다. 테트라클로드 배아는 배반성 단계로 발전할 수 있다. iPSC는 그 때 임신을 위한 수신자 여성으로 이식되는 blastocyst로 주입됩니다. 테트라클로이드 세포는 태반과 같은 배아 구조를 형성할 수 있으므로 이 방법으로 인한 동물은 iPSC에서 완전히 파생됩니다.

일부 연구자들은 성공적으로 다시 프로그래밍된 세포를 보다 효율적으로 식별하는 프로세스를 만들기 위해 재프로그래밍 절차를 수정합니다. 예를 들어, 이 실험에서 10월4촉진자의 영향으로 녹색 형광단백질을 발현할 수 있는 능력을 가진 MEF는 연구원들이 편성을 획득한 세포를 쉽게 식별할 수 있도록 도왔습니다.

당신은 유도 된 다능성 줄기 세포를 생성에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 이 절차의 원리와 분화된 셀에서 iPSC를 생성하는 단계별 프로토콜을 검토했습니다. 또한 랩 내 실험에 이 메서드를 적용하거나 수정할 수 있는 방법을 검토했습니다.

iPSCs의 발견은 퇴행성 무질서를 취급하기 위하여 이용될 수 있는 치료를 개발하기 위한 거대한 잠재력이 있기 때문에, 줄기 세포 생물학의 필드에 큰 충격을 가했습니다. 비록 많은 진전이 iPSC로 이루어졌더라도, 아직도 교차해야 하는 장애물은 암의 관련 리스크입니다. 현재 의 재프로그래밍 절차는 암을 초래할 수 있는 관계가 없는 세포 성장 귀착될 가능성이 있습니다. 따라서 실제로 iPSC를 임상적으로 사용하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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