Eksperimentel protokol til påvisning af mitokondriel funktion i hepatocytter udsat for organochlorpe pesticider

Det er en messer, der kalder besvare et centralt spørgsmål, som du har i også en funktion af området som ATP-niveau og iltforbrug satser. Den nye eller den ene side gamle, denne teknik er, at det er nemt at udføre, og det er en masse for en særlig evaluering af cellulære mitokondrielle funktion. For at starte dette eksperiment, frø 20, 000 HepG2 celler i et glas bund Petriskål.

Tilsæt beta-hexachlorcyclohexan eller B-HCH i inkubator ved 37 grader Celsius og fem procent CO2 i 24 timer. Forbered en millimolar mitokondriel grøn fluorescens sonde løsning ved at tilføje vandfri DMSO til DMEM cellekultur medium. Derefter tilsættes en milliliter pr fad af denne opløsning til cellerne i glasbund petriskåle.

Og inkubere ved 37 grader Celsius i 45 minutter. Efter inkubation fjernes mitokondrielle grønne lysstofrøropløsning fra cellerne. Tilsæt en milliliter pr fad frisklavet ved 37 grader Celsius DMEM cellekultur medium.

For at opdage grøn fluorescens i mitokondrier, observere cellerne under et konfokal mikroskop. At vurdere niveauet af cellulære ATP, frø til 20, 000 HepG2 celler i seks brøndplader. Tilsæt beta-HCH og inkubere ved 37 grader Celsius i 24 timer.

Tilføj 200 mikroliter lysis buffer til cellerne i hver brønd. Centrifuge ved 12,000 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius, og fortsæt med at indsamle supernatant som beskrevet i tekstprotokollen. Tilføj 100 mikroliters ATP-detektionsbuffer til pladen.

Tilføj 100 mikroliter af indsamlet celle supernatant til en 96 brøndplade ved stuetemperatur og fortsatte med at detektere cellulære ATP ved et luminometer som beskrevet i tekstprotokollen. Til vurdering af mitokondriel membran potentiale, vokse HepG2 celler i seks brønd plader med tilsætning af beta-HCH, som tidligere beskrevet. Indsamle cellerne ved at fordøje dem med 0,5 milliliter 0,25% EDTA i et minut ved 37 grader Celsius.

Der tilsættes en milliliter DMEM for at stoppe fordøjelsen og overføre de fordøjede celler til 1,5 milliliterrør. Centrifuge rørene ved 1000 gange G i tre minutter, og kassér derefter supernatanten. Cellepellet fortyndes med 0,5 milliliter cellekulturmedium og 0,5 milliliter JC1 mitokondriemembran potentiel farvestof.

Og inkubere i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Dernæst centrifuge rør på 600 gange G i tre minutter ved fire grader Celsius, og derefter vaske celle pellet i henhold til teksten protokol. Efter centrifugering af vasket pellet, fjerne supernatant.

Og re-suspendere pellet i 0,5 milliliter JC1 farvning buffer. Analysér JC1 farvede celler via flow cytometri at opdage grøn og rød fluorescens. Når JC1 monomer detekteres, indstilles excitationslyset til 490 nanometer og emissionslyset til 530 nanometer.

Når JC1-polymeren detekteres, indstilles excitationslyset til 525 nanometer og emissionslyset til 590 nanometer. At analysere iltforbrug sats, frø HepG2 celler i en 96 godt celle kultur plade i en tæthed på 4, 500 celler pr 100 mikroliter per brønd. Efter 24 timers inkubation ved 37 grader Celsius, sørg for, at cellerne i hver brønd er dækket med medium.

Før OCR-softwaren køres, skal mikropladen med patron og cellekulturpladen indlæses i en ekstracellulær fluxanalysator som beskrevet i tekstprotokollen. Åbn OCR-softwaren, og vælg celle mito stresstestsæt i app-rullemenuen i apps, og klik på startappknappen. Klik derefter på stresstestknappen.

Når celle stresstest skærmen vises, skal du indtaste antallet af celler såning per brønd i cellen såning nummer boks og den gennemsnitlige OCR i gennemsnittet på basal celle OCR boks. Den endelige arbejdskoncentration for hvert reagens ind, og injicer derefter reagenserne. Klik på den næste knap.

Når skærmbilledet gruppeoplysninger vises, skal du tildele en gruppe til ikke-tildelte brønde ved at vælge en farve og give et navn. Klik derefter på de relevante brønde. Klik på den næste knap og i stresstest injektion layout skærm, der vises, skal du klikke på start for at køre stresstest på analysatoren.

Når det er gennemført, skal du følge instruktionerne i softwaren og derefter fjerne patronen og cellepladen. Den gennemsnitlige intensitet af mitokondriel grøn fluorescerende farvning faldt i HepG2-celler, der blev eksponeret for beta-HCH. Dette viser, at der er et fald i mitokondrielt antal og stigning i beskadigede mitokondrier i overensstemmelse med stigningen i pesticidkoncentrationen.

Desuden faldt ATP-niveauerne i HepG2-celler med de øgede koncentrationer af beta-HCH-eksponering, hvilket viste den nedsat funktion af mitokondrier i disse celler. Efter JC1 farvning for mitokondrielle membran potentiale, eller MMP, flow cytometer viste høj rød grøn JC1 fluorescens i intakt HepG2 celler. Dette skyldtes tilstedeværelsen af røde fluorescerende JC1 aggregater, som er et tegn på høj MMP.

I celler behandlet med beta-HCH faldt den rødgrønne JC1-fluorescens på grund af tilstedeværelsen af grønne fluorescerende JC1 monomerer, et tegn på lav MMP. Endelig faldt iltforbruget også med de øgede koncentrationer af beta-HCH eksponering, hvilket yderligere viser, at dette pesticid svækker korrekt mitokondriel funktion. Åh, ja, forsøg på at denne procedure, er det vigtigt selv, at huske at se, at cellerne som passende at teste det.

Efter dens udvikling, dette absolut baner en måde for forsker inden for grundlæggende funktion til at udforske relevante organismer i den medicinske rolle forbundet med det. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du registrerer en mængde eller kvalitet, kapacitet, nu medlem eller potentiale under tudse ark funktion.