Saggi di co-immunoprecipitazione e pull-down
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Overview
I saggi di co-immunoprecipitazione (CoIP) e pull-down sono metodi strettamente correlati per identificare interazioni proteine-proteine stabili. Questi metodi sono correlati all’immunoprecipitazione, un metodo per separare una proteina bersaglio legata a un anticorpo da proteine non legate. In CoIP, una proteina legata agli anticorpi è a sua volta legata a un’altra proteina che non si lega con l’anticorpo, questo è seguito da un processo di separazione che preserva il complesso proteina-proteina. La differenza nei saggi pull-down è che le proteine esca marcate con affinità sostituiscono gli anticorpi e la cromatografia di affinità viene utilizzata per isolare complessi proteina-proteina.
Questo video spiega il CoIP, i test pull-down e la loro implementazione in laboratorio. Viene trattato un protocollo passo-passo per ogni tecnica, inclusi i reagenti, gli apparecchi e gli strumenti utilizzati per purificare e analizzare le proteine legate. Inoltre, la sezione applicazioni di questo video descrive una procedura per studiare come le proteine del mixovirus inibiscono la nucleoproteina dell’influenza, un’indagine sul ruolo degli ioni calcio nella calmodulina tramite un test pull-down e un test pull-down modificato per caratterizzare le interazioni proteiche transitorie.
Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo significativo in un’ampia varietà di funzioni biologiche. La maggior parte delle interazioni proteina-proteina e i loro effetti biologici devono ancora essere identificati. La co-immunoprecipitazione, o CoIP, e i test pull-down sono due metodi strettamente correlati per l’identificazione di interazioni proteine-proteine stabili. Questo video coprirà i principi dei due saggi, le loro procedure di laboratorio generali e le applicazioni di queste tecniche.
CoIP e test pull-down sono varianti di immunoprecipitazione, un metodo per isolare selettivamente una specie proteica da una soluzione complessa. In un esperimento di immunoprecipitazione, un anticorpo specifico di una proteina bersaglio è autorizzato a formare un immuno complesso con quel bersaglio nel campione. Il complesso viene quindi catturato su un supporto solido, tipicamente la proteina A legata a una perla di sefarosio. Tutte le proteine non catturate vengono rimosse mediante fasi di centrifugazione. La proteina viene quindi rilasciata dall’anticorpo e dal supporto solido mediante ebollizione nella riduzione del buffer di carico del campione SDS-PAGE.
La co-immunoprecipitazione è condotta nello stesso modo, tranne per il fatto che i complessi proteici intatti vengono catturati sul supporto solido. L’anticorpo si lega alla proteina bersaglio, che a sua volta è legata a un’altra proteina che non è presa di mira dall’anticorpo. Come nell’immunoprecipitazione, il complesso proteico viene rilasciato dall’anticorpo e dal supporto solido mediante ebollizione nella riduzione del tampone di carico del campione SDS-PAGE.
I test di pull-down sono simili alla co-immunoprecipitazione, differendo solo nell’uso di una proteina “esca”, al contrario di un anticorpo. Attraverso tecniche di biologia molecolare, questa proteina esca viene ingegnerizzata con un tag di affinità, come una serie di residui di istidina. Questi tag di affinità sono descritti in “Separazioni biomolecole basate sulla cromatografia”. La proteina viene quindi catturata su un ligando di affinità immobilizzato specifico per il tag. La proteina catturata viene quindi incubata con un campione che contiene proteine che formano complessi con l'”esca”. Il complesso proteico viene rilasciato dal supporto di affinità mediante lavaggio con una soluzione contenente un analita competitivo specifico per il tag sulla proteina “esca”. I test pull-down sono utili per confermare le interazioni proteiche previste dalla co-immunoprecipitazione e per scoprire interazioni proteiche sconosciute.
Ora che i principi di co-immunoprecipitazione e i test di pull-down sono stati discussi, diamo un’occhiata alle loro procedure di laboratorio.
Per prima cosa discutiamo della co-immunoprecipitazione. A una serie di tubi di microfuga, si aggiunge quanto segue: tampone PBS e una soluzione al 50% di proteina A-sefarosio, un complesso resina-proteina che si lega all’anticorpo. I tubi del microfuga vengono ruotati per garantire una corretta distribuzione, quindi la resina viene lavata con un buffer PBS aggiuntivo. Il lisato cellulare, contenente la proteina desiderata, e 2 μg di anticorpo vengono aggiunti ai tubi del microfugo e la miscela viene ruotata per 1 ora a 4 °C. Le perle vengono pellettizzate mediante centrifugazione, il surnatante viene scartato e le perle rilavate tre volte con tampone per rimuovere le proteine non legate. Le pere contenenti il complesso anticorpo-proteina sono in riduzione del tampone di carico del campione SDS-PAGE, per la rimozione del complesso dall’anticorpo e per l’analisi mediante SDS-PAGE e immunoblotting.
Ora discuteremo la procedura per i saggi di pull-down: la proteina “esca” è espressa in un plasmide con il tag di affinità appropriato. Dopo aver raggiunto la crescita in fase logaritria, le cellule vengono lizzate e quindi centrifughe. Le perle di streptavitina-sefarosio sospese, che catturano la proteina “esca” etichettata con biotina, vengono pipettate in un tubo di microfuga. Le perle vengono quindi centrifugate e il surnatante accuratamente rimosso mediante aspirazione. Le perle vengono quindi lavate con tampone, centrifugate e il surnatante rimosso.
Le cellule contenenti la presunta proteina “preda”, che ha un’affinità per la proteina “esca”, vengono raccolte mediante centrifugazione. Il surnatante viene quindi aggiunto al tubo del microfugo contenente la resina e incubato a 4 °C per 3 ore su uno shaker. La resina viene quindi centrifugata, il surnatante rimosso e la resina lavata per rimuovere le proteine non legate. Il tampone di eluizione viene aggiunto alla resina e la miscela viene incubata a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker. La resina viene quindi centrifugata e il surnatante contenente il complesso desiderato viene analizzato mediante immunoblotting.
Ora che abbiamo esaminato le procedure, diamo un’occhiata ad alcune delle applicazioni utili della co-immunoprecipitazione e dei test di pull-down.
La coimmunoprecipitazione può essere utile per comprendere meglio il meccanismo d’azione degli enzimi. Le proteine di resistenza al mixovirus, o Mx-, inibiscono una vasta gamma di virus, tra cui l’influenza A, per i quali il meccanismo è poco compreso. La co-immunoprecipitazione è stata utilizzata per studiare l’interazione tra la proteina Mx1 del topo e la nucleoproteina dell’influenza.
I test pull-down si sono dimostrati utili nello studio degli effetti dei secondi messaggeri, che sono proteine che comunicano un segnale dall’ambiente cellulare. Sono un componente di una via di segnalazione in cui più proteine interagiscono in risposta a segnali ambientali. Gli ioni calcio agiscono come messaggeri secondari legandosi alla calmodulina, che a sua volta si lega a un’ampia varietà di proteine, mediando molti tipi di risposte biologiche. Senza il calcio, la proteina non può legarsi alla calmodulina. È stato condotto un test di pull-down per testare la capacità delle proteine di legarsi alla calmodulina in presenza o assenza di ioni calcio.
I saggi di co-immunoprecipitazione e pull-down sono generalmente utilizzati per analizzare le interazioni proteiche stabili o forti, ma non quelle transitorie. Un recente sviluppo nei saggi pull-down, l’HaloTag, ha semplificato lo studio delle interazioni proteiche transitorie; HaloTag è un tag di fusione proteica geneticamente codificato, fuso alla proteina di interesse, in grado di reagire chimicamente con un supporto solido aloalcano. Se si desidera un’analisi funzionale, il complesso proteico, meno il tag, nella sua interezza potrebbe quindi essere isolato incubando con proteasi del virus dell’incisione del tabacco.
Hai appena visto il video di JoVE sulla co-immunoprecipitazione e sui test di pull-down. Questo video descrive i principi dei due metodi, le procedure generali di laboratorio e alcune delle loro applicazioni.
Grazie per l’attenzione!
Procedure
Disclosures
Transcript
Protein-protein interactions play a significant role in a wide variety of biological functions. The majority of protein-protein interactions and their biological effects have yet to be identified. Co-immunoprecipitation, or CoIP, and pull-down assays are two closely related methods for the identification of stable protein-protein interactions. This video will cover the principles of the two assays, their general laboratory procedures, and applications of these techniques.
CoIP and pull-down assays are variants of immunoprecipitation, a method for selectively isolating a protein species from a complex solution. In an immunoprecipitation experiment, an antibody specific to a target protein is allowed to form an immune complex with that target in the sample. The complex is then captured on a solid support, typically protein A bound to a sepharose bead. Any proteins not captured are removed by centrifugation steps. The protein is then released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer.
Co-immunoprecipitation is conducted in the same manner, except that intact protein complexes are captured onto the solid support. The antibody binds to the target protein, which, in turn, is bound to another protein that is not targeted by the antibody. As in immunoprecipitation, the protein complex is released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.
Pull-down assays are similar to co-immunoprecipitation, differing only in the use of a “bait” protein, as opposed to an antibody. Through molecular biology techniques, this bait protein is engineered with an affinity tag, such as a series of histidine residues. These affinity tags are described in “Chromatography-based Biomolecule Separations.” The protein is then captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag. The captured protein is then incubated with a sample that contains proteins that form complexes with the “bait”. The protein complex is released from the affinity support by washing with a solution containing a competitive analyte specific for the tag on the “bait” protein. Pull-down assays are useful for confirming protein interactions predicted by co-immunoprecipitation, and for discovering unknown protein interactions.
Now that the principles of co-immunoprecipitation and pull-down assays have been discussed, let’s look at their laboratory procedures.
First let’s discuss co-immunoprecipitation. To a series of microfuge tubes, the following is added: PBS buffer, and a 50% solution of protein A-sepharose, a resin-protein complex that binds to the antibody. The microfuge tubes are rotated to ensure proper distribution, and then the resin is washed with additional PBS buffer. Cell lysate, containing the desired protein, and 2 μg of antibody are added to the microfuge tubes, and the mixture is rotated for 1 h at 4 °C. The beads are pelleted by centrifugation, the supernatant is discarded, and the beads re-washed three times with buffer to remove non-bound protein. The beads containing the antibody-protein complex are in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer, for removal of the complex from the antibody and for analysis by SDS-PAGE and immunoblotting.
Now we will discuss the procedure for pull-down assays: The “bait” protein is expressed in a plasmid with the appropriate affinity tag. After reaching log-phase growth, the cells are lysed, and then centrifuged. Suspended streptavidin-sepharose beads, which capture biotin-tagged “bait” protein, are pipetted into a microfuge tube. The beads are then centrifuged and the supernatant carefully removed by aspiration. The beads are then washed with buffer, centrifuged, and the supernatant removed.
Cells containing the putative “prey” protein, which has an affinity for the “bait” protein, are harvested by centrifugation. The supernatant is then added to the microfuge tube containing the resin, and incubated at 4 °C for 3 h on a shaker. The resin is then centrifuged, the supernatant removed, and the resin washed to remove non-bound protein. Elution buffer is added to the resin, and the mixture is incubated at room temperature for 30 min on a shaker. The resin is then centrifuged, and the supernatant containing the desired complex is analyzed by immunoblotting.
Now that we’ve reviewed the procedures, let’s look at some of the useful applications of co-immunoprecipitation and pull-down assays.
Co-immunoprecipitation can be useful in better understanding of enzymes’ mechanism of action. Myxovirus-, or Mx-, resistance proteins inhibit a wide range of viruses, including influenza A, for which the mechanism is poorly understood. Co-immunoprecipitation was used to study the interaction between mouse Mx1 protein and influenza nucleoprotein.
Pull-down assays have proven useful in studying the effects of second messengers, which are proteins that communicate a signal from the cellular environment. They are a component of a signaling pathway where multiple proteins interact in response to environmental cues. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can’t bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.
Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions; HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.
You’ve just watched JoVE’s video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.
Thanks for watching!
