Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Het algemene doel van dit essay, is om macrofagen en opsonized rode bloedcellen voor te bereiden voor de visualisatie van Phagocytose door driedimensionale time lapse microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals hoe fagocyten deeltjes vangen en innemen. Deze techniek maakt het mogelijk om deeltjesopname in real time te visualiseren, in tegenstelling tot meer traditionele eindpunttesten die alleen de beoordeling mogelijk maken van de vraag of, maar niet hoe, een deeltje is ingenomen.

Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn bij deze methode worstelen totdat ze gewend raken aan de celisolatieprocedures. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we de voordelen van het spinnen van deze confocale microscopie voor 3D time-lapse beeldvorming van Phagocytosis realiseerden. Om buikvliesmacrofagen te isoleren, plaats een 24-meter plastic katheter in het buikvlies van een drie tot vier maanden oude muis, en gebruik een plastic vijf milliliter spuit om de holte twee keer lavage met 4,5 milliliter ijskoude HBSS zonder calcium en magnesium per lavage.

Het overbrengen van de aangezogen suspensie in een 14-milliliter polypropyleen ronde bodembuis als het wordt verzameld. Wanneer beide monsters zijn geoogst, centrifugeren de aanzuigen, en resuspend de peritoneale cellen in een milliliter van volledige bicarbonaat vrije RPMI 1640 medium te bereiken ongeveer een zes keer 10 tot de zesde cellen per milliliter concentratie. Voeg vervolgens voor het vullen van dia’s een milliliter van het volledige HEPES-medium toe aan een reservoir van een met fibronectin gecoate kanaalschaar, en kantel de dia zodat het medium uit het stroomafwaartse reservoir kan worden aangezogen.

Om ongewenste luchtbellen te verwijderen, voeg een tot twee milliliter vers medium toe aan een van de twee reservoirs en breng een reservoirdop stevig aan. Breng vervolgens ritmische duimdruk op de dop om eventuele lucht uit de dia te pompen, waardoor de glijbaan zo nodig kantelt. Wanneer alle lucht is verdreven, kantel de glijbaan naar het niet-afgetopte medium met reservoir en verwijder de dop om te voorkomen dat lucht wordt teruggezogen in het kanaal.

Nu pipette de cel oplossing een paar keer te verminderen klonteren, en voeg 100 microliter van de cellen in een kanaal van de dia voor een twee uur incubatie in een vochtige kamer op 37 graden Celsius bij afwezigheid van kooldioxide. Aan het einde van de incubatie vervangen de HEPES met medium in elke dia met volledige bicarbonaat aangevuld medium zoals net aangetoond. Plaats vervolgens de cellen in een 37 graden celsius vochtige incubator met 5% kooldioxide voor hun nachtelijke cultuur.

De volgende ochtend breng een milliliter vers verkregen gezond donorbloed in een twee milliliter ronde polypropyleen microcentrifuge buis. Centrifuge het monster dan. Verwijder het plasma en buffy jas met supernatant.

En breng zorgvuldig 100 microliter van de gesedimenteerde rode bloedcellen over naar een twee milliliter mircocentrifugebuis met 100 microliter van volledig HEPES-aangevuld medium. Label de buis 1:1 en breng vier microliter van de verdunde rode bloedcellen over in een nieuwe twee milliliter microcentrifugebuis met twee milliliter van volledig HEPES-aangevuld medium. Label dan deze buis 4:2000 en plaats beide verdunde rode bloedcellen monster buizen op ijs.

Voor het labelen van de buikvliesmacrofagen vervangt u het bicarbonaatmedium in elke kanaaldia door complete mediums aangevuld met HEPES. Dan kantelen van de dia om 100 microliter van de fluorescerend getagd muis macrofaag specifieke antilichaam van belang worden toegevoegd druppel verstandig aan de opening van de 100 microliter kanaal van de dia. Aspiraat het medium dat stroomt in het downstream reservoir, en inculbateren de cellen gedurende 20 minuten in een vochtige kamer op 37 graden Celsius in de afwezigheid van kooldioxide.

Terwijl de peritoneale cellen worden gelabeld voorzichtig mix 4:2000 rode bloedcellen monster en breng 400 microliter van de cellen in een nieuwe twee milliliter microcentrifuge buis, in een verwarmd aluminium blok in een laminaire flow hood voor ongeveer vijf tot acht minuten. Wanneer de cellen zijn opgewarmd tot 37 graden Celsius meng 0,4 microliter van een geschikte rode fluorescerende plasma membraan vlek met de cellen. Plaats vervolgens de cellen terug in het warmteblok.

Na vijf minuten was de cellen door het toevoegen van 1,6 milliliter verse HEPES aangevuld compleet medium en centrifuge. Draai de buis om de rode bloedcelpellet te identificeren. Met behulp van een tot 1,5 milliliter pipet tip zorgvuldig verwijderen van de supernatant in twee volumes zonder verstoring van de pellet en meng 2000 microliters van verse HEPES aangevuld compleet medium met de cellen.

Centrifugeren en opnieuw opschorten de pellet in 400 microliters van medium. Label vervolgens de buis PMS voor Plasma Membraan Vlek. Aan het einde van de 20 minuten peritoneale cel labelen incubatie wassen de dia met een milliliter verse volledige HEPES aangevuld medium.

Om de rode bloedcellen opsonize voeg een microliter van de muis IGG2B monoklonale anti menselijke CD235A antilichaam aan de PMS monster buis. Na acht minuten bij 37 graden celsius met het mengen eenmaal per minuut overdracht 100 microliters van het plasmamembraan gekleurd IGG opsonized menselijke rode bloedcellen naar de peritoneale macrofaag met kanaal dia. Zodra de menselijke rode bloedcellen zijn toegevoegd mount de dia op een draaiende schijf confocale microscoop.

Met het podium incubator ingesteld op 37 graden Celsius en onmiddellijk beginnen met het beeldvorming van de cellen. Time lapse 3D-imaging van groene fluorescerende macrofagen gepresenteerd met rode fluorescerende menselijke rode bloedcellen maakt de visualisatie van enkel deeltje fagocytische gebeurtenissen mogelijk. Bijvoorbeeld, de vangst van een muis IGG opsonized menselijke rode bloedcel door een macrofaag filopodium kan worden waargenomen.

Evenals, het knijpen van een menselijke rode bloedcel tijdens fagocytische bekervorming. Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe de muis ingezetene peritoneale macrofagen, fluorescerend gelabelde cellen en opsonized deeltjes te isoleren.