Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Biologiske forenelighed profil på biomaterialer for knogle regenerering
Summary November 16th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Antallet af roman biomaterialer manipuleret til at reparere store knogle læsioner løbende udvide med formålet at forbedre knogleheling og overvinde komplikationer forbundet med knogle transplantation. Vi præsenterer her, en tværfaglig strategi for prækliniske biokompatibilitet testning af biomaterialer for knogle reparation.
Transcript
Disse metoder kan hjælpe med at besvare de vigtigste spørgsmål inden for biomaterialer. Især for knogle regenerering. De bruges til at evaluere effektiviteten af biomaterialer og potentielle immunrespons.
Den største fordel ved denne tværfaglige platform er, at den giver en række parametre til forudsigelse af biokompatibilitet af biomaterialer, der anvendes til knoglereparation. Konsekvenserne af disse in vitro og in vivo knogle teknikker strækker sig i retning af andre knoglelidelser. På grund af behovet for præklinisk screening af nye ortopædiske biomaterialer.
Den dermatologiske metode kan give indsigt i biomaterialer til knogleheling, det kan også anvendes til biomateriale vurderinger for enhver anden klinisk indikation. Aspiratkulturmedium fra primær osteoblaster 14 dage efter tilsætning af osteogen mineraliseringsmedium. Skyl to gange med 0,5 milliliter 1X PBS.
Derefter fastgør cellerne ved at tilføje 0,5 milliliter 10% buffered formalin opløsning og inkubering ved stuetemperatur i 10 minutter. Efter 10 minutter, aspirere 10% buffered formalin med en engangsrøret og vask to gange med 0,5 milliliter ultrarent vand. Derefter tilsættes 250 mikroliter af 40 millimolar Alizarin Red S farvning opløsning til de faste osteoblaster.
Og inkuber pladen ved stuetemperatur i 10 minutter på en shaker ved 100 rystelser i minuttet. Efter inkubationen med farvningsopløsning aspirerer farvningsopløsningen med et engangsrør og skylles med en milliliter ultrarent vand. Gentag dette trin fem til 10 gange, indtil skylleopløsningen kommer klart ud for at fjerne uspecifik farvning.
Efter indsugning af den endelige vask tilsættes en milliliter kold PBS. Og inkuber pladen ved stuetemperatur i 10 minutter på en shaker som før. Dernæst overføre de farvede beta tricalcium fosfat diske til en ny brønd og scanne pladerne med en flatbed scanner til at registrere mineralisering.
Efter billedoptagelse tilsættes 250 mikroliter af 10% cetylpyridiniumchloridopløsning og ryst i 15 minutter for at udtrække Alizarin Red S-farvestoffet. Dernæst overføres opløsningen fra brøndene til individuelle 1,5 milliliterrør og centrifugeres ved 17.000 x g i fem minutter ved stuetemperatur. Ekstraktet fortyndes med 10%cetylpyridiniumchloridopløsning ved en fortyndingsration på 1:10 til 1:20 i et 1,5 milliliterrør.
Overfør derefter 300 mikroliter af hver fortyndet prøve i brøndene på 96-brøndpladen. Medtag to blanke brønde, der kun indeholder 10% cetylpyridiniumchlorid. Dernæst forberede syv Alizarin Red S referencestandarder spænder fra 4 400 mikromolar ved at fortynde 40 milliomolar Alizarin Red S farvning løsning med 10% cetylpyridiniumchlorid løsning til at generere en standard kurve.
Læg 300 mikroliter af hver standard i pladen. Endelig læses prøverne, emnerne og referencestandarderne ved 520 nanometer. Isoler knoglemarvstoplastprækursorer fra lårben og skinneben i en aflivet mus ved hjælp af sterile saks til at fjerne benene fra kroppen ved hofteleddet.
Skær lemmerne på knæ og ankel leddene og fjerne det bløde væv med steril skalpel og scer. Skær epifyserne af. Indsæt en 27 gauge nål fastgjort til en sprøjte fyldt med en milliliter knoglevækst medium i lumen og skylle ud marven i en seks centimeter steril petriskål.
Efter at have gentaget dette for alle lårben og skinneben, overføres cellesuspensionen til et konisk rør på 50 milliliter. Vask den seks centimeter høje petriskål med fem milliliter knoglevækstmedium og overfør den til det samme koniske rør på 50 milliliter. Centrifuge ved 350 x g ved fire grader Celsius i fem minutter.
Efter centrifugering re-suspendere cellerne i en milliliter pr brønd af osteoklast differentiering medium. En BALB/c mus giver et tilstrækkeligt antal osteoklastprækursorer til en 24-brønds kulturplade. Tilføj primære osteoblaster suspenderet i knoglevækst medium på biomateriale og kontrollerne på 8.8*10^4 celler per kvadratcentimeter.
Beta tricalcium fosfat skiver, kontrolleret kvægknogle, og væv kultur plast anvendes her. Inkuberes ved 37 grader celsius i fem procent kuldioxid i 24 timer. Efter 24 timer tilsættes friskisolerede knoglemarvsgoooklastprækursorer og osteoklastdifferentieringsmedium til de kultiverede primære osteoblaster og vende tilbage til væksthuset i fem dages kultur ved 37 grader celsius ved fem procent kuldioxid.
Udskift mediet med frisklavet osteoklastdifferentieringsmed hver anden dag. Derefter pletter osteoklaster for tartrat resistent syre fosfatase til at evaluere differentiering. Barber hovedbunden af en bedøvet otte uger gammel BALB / c mus og rense overfladen med 7,5% povidone jod opløsning og 70% ethanol.
Dæk øjnene med oftalmologiske salve for at forhindre tørring under proceduren. Sørg for et passende niveau af anæstesi ved manglende reaktion på en tå og hale knivspids. Så efter at en midline sagittal snit fjerne parakranium bindevæv over højre parietal knogle ved at skrabe det med en skalpel.
Brug derefter en steril tandtrens med en diameter på fire millimeter ved 2000 rotationer i minuttet for at skabe en kritisk defekt i højre parietal knogle. Konstant overrisle regionen med steril saltvandsopløsning, mens hak den rigtige parietal knogle og skære gennem ectocortext og nogle endocortex. For at undgå skader på Dera Mater skal du bruge en lille periosteal elevator til at bryde igennem den resterende enddocortex.
Brug derefter vicess til forsigtigt at løfte calvarial knoglen og fjerne den. Den resulterende defekt skal være cirkulær og ca. 3,5 millimeter i diameter. Dernæst fylde calvarial defekt med beta tricalcium fosfat kollagen skum, presoaked i sterile PBS.
For at holde biomaterialet på plads anvendes 0,5 mikroliter vævsklæbemiddel for enden af defekten på to modsatte punkter. Luk derefter huden med en sutur, der ikke kan absorberes. Placer en bedøvet mus på ryggen, barber abdominal pels og rense den barberede overflade med 7,5% povidone jod opløsning og 70% ethanol.
Efter at have lavet en otte millimeter lang midterlinje snit gennem huden langs linea alba af maven, implantat PBS gennemblødt biomateriale under huden. Derefter sutur huden med en nonabsorbable sutur. Otte uger efter implantationen, punktafgifter implantationsstedet med omgivende væv fra den aflivede mus.
Dette billede viser, at væksten på beta tricalciumphosphatdiske vist i åbne stænger ikke påvirker osteoblast levedygtighed i forhold til vækst på væv kultur plast på syv og 14 dages kultur. Kultiveret osteoblaster blev plettet med Alizarin Red S efter 14 dage. Mineralisering var højere for mineralisering medium kontrol sammenlignet med osteoblaster dyrket i medium alene.
Og på beta tricalcium fosfat diske i suspension kultur brønde. Når en kirurgisk induceret kritisk størrelse calvarial defekt blev efterladt tom, et tyndt lag, der dækker hele defekten blev observeret, men ingen signifikant knogledannelse var til stede på 12 uger efter operationen. I modsætning hertil, når defekten indeholdt beta tricalcium fosfat kollagen skum, skum rester omgivet af tæt fibrøst væv, herunder nogle blodkar og inflammatoriske celler brode defekten området uden tegn på knogledannelse.
Efter subkutan beta tricalcium fosfat kollagen skum implantation, en inflammatorisk reaktion med fremmedlegeme gigantiske celler blev observeret på hæmatoxylin og Eosin-farvede sektioner et tegn på fibrose på Masson's trichrome farvede sektioner på otte uger. I modsætning hertil havde implantationsstedet for fingeret kontrol minimal inflammation og ingen fibrose. Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at gøre præcis og reproducerbar hak af golgata uden at såre dyret.
Efter denne procedures andre metoder som osteoklast differentieringsanalyser analyser og høj gennemløb i peritoneal immun modeller kan præformes for at besvare yderligere spørgsmål som osteoklast svar på biomaterialer og type immunrespons.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
