Login processing...

JoVE Journal
Bioengineering

This content is Open Access.

JoVE Journal Bioengineering

Isolation og Decellularization af en hele svin bugspytkirtel

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

Journal (Bioengineering)

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Journal (Bioengineering)

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Click here for the English version

Isolation og Decellularization af en hele svin bugspytkirtel

Article DOI: 10.3791/58302

October 10th, 2018 •

Vijay Kumar Kuna*¹, Niclas Kvarnström*², Erik Elebring¹, Suchitra Sumitran Holgersson¹

¹Department of Surgery, Institute of Clinical Sciences, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, ²The Transplant Institute, Sahlgrenska University Hospital

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 10th, 2018

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vævsmanipulering af hele bugspytkirtlen er en udfordring på grund af dens eksokrine og endokrine funktioner. Vi viser en metode til dissektion af en intakt svin bugspytkirtlen og processen af vellykkede decellularization af perfusion af detergenter Triton X-100, natrium deoxycholate og deoxyribonuclease.

Transcript

Denne metode kan anvendes til dissektion af svine pancreas indeholder tilslutning, duodenal, og milt lapper og eventuel decellularization via perfusion af rengøringsmidler ved kolde temperaturer. Selv om denne metode til decellularization giver indsigt i svinet bugspytkirtlen, Det kan også anvendes til pancreata fra andre store dyr. Den største fordel ved denne teknik er, at det letter intakt hentning af et kompliceret organ, såsom bugspytkirtlen, for yderligere væv engineering applikationer.

Generelt, individer nye til denne metode, de vil kæmpe, fordi dissektion af den intakte bugspytkirtel samtidig identificere og ligating alle de omkringliggende blodkar kræver en masse praksis at mestre. Før du begynder proceduren, skal du bruge en tre-af-fem-millimeter silikone rør til at forbinde vaskemiddel beholder til peristaltiske pumpe og en anden tre-by-fem-millimeter silikone rør til at forbinde peristaltiske pumpe til orgel kammer via degasser. Tilslut en han luer til den frie ende af det andet rør, og brug en tredje tre-af-fem-millimeter silikone rør til at forbinde orgel kammer til vaskemiddel indsamling beholder via peristaltiske pumpe.

Til sidst skal du tilslutte en to millimeter uretter uden etiket til de frie ender af rørene i vaskemiddelbeholderen og vaskemiddelopsamlingsbeholderen. Placer derefter decellulariseringsopsætningen ved fire grader Celsius. At høste bugspytkirtlen, placere en hepariniseret, 45-kilogram, hun svin på en dissektion bordet i liggende position, og bruge en skalpel til at gøre en 40-centimeter midterlinjen snit fra xiphoid processen til skambenet at udsætte abdominale organer.

Efter at have identificeret milt, duodenal, og tilslutning lapper, finde de store duodenal papilla, og bruge to individuelle suturer til mundtligt ligate duodenum fra webstedet. Ligate ringere spiserøret med yderligere suturer, og skæres mellem ligaturer med en saks for at lette fjernelse af maven. Adskiv bindevæv fra tyktarmen for at nå tyndtarmen, og adskille bindevæv i tyktarmen, der tillægger miltlappen i bugspytkirtlen.

Tyndtarmen er knyttet til bugspytkirtlen ved bindevæv på miltlappen, men også omgiver bugspytkirtlen. Du er nødt til nøje at følge tarmvejen for at detangle og adskille bindevæv mellem tarmen og bugspytkirtlen. Efter ligating arterierne, fjerne tyktarmen fra tyndtarmen.

Identificer ringere mesenteric vene, ringere mesenteric arterie træ, og ligte fartøjerne med en sutur caudal til bugspytkirtlen og skæres med en saks. Ligate milt arterie og vene sammen i hilum, tæt på milten, og skæres distalt med en saks for at fjerne milten. Følg duodenum, indtil duodenal og tilslutning lapper er ryddet, og ligate duodenum i slutningen med to separate suturer.

Den del af duodenum, der er i tæt kontakt med forbindelsen og duodenal lapper fjernes med bugspytkirtlen, som ligation af alle de små blodkar mellem de to organer er for svært. Efter dissekering af portalvenen, ligte beholderen med en sutur for at forhindre blodlækage fra leveren, og dissekere og ligte galdegang og leverpulsåren med to suturer. Derefter skæres portal vene, leverpulsåren, og galdegang med en saks.

Find aorta under nyrevene, og dissekere aorta i kranieretningen fra musklen og bindevæv, indtil fartøjet når bugspytkirtlen. Nu forsigtigt vende bugspytkirtlen over, og dissekere aorta, holde den overlegne mesenteric arterie og cøliaki stammen intakt. Skær aorta kraniet til cøliaki stammen, og stump dissekere de resterende omgivende væv til at tillade høst af bugspytkirtlen.

Brug derefter en 50-milliliter sprøjte forbundet til en fire-millimeter arteriotomi kanyle til at skylle orglet gennem aorta med opløsning to, indtil hele organet er perfunderet, eller indtil hele orglet bliver koldt. Anvend opløsningen to perfunderes bugspytkirtlen på en metalbakke på is, med aorta opad, og brug en saks til at skære suturerne fra duodenum. Brug en 25-milliliter pipette til at skylle duodenum med 50 til 150 milliliter ultrarent vand, og religate vævet med friske suturer.

Ligate den ene ende af aorta og alle grene, bortset fra den overlegne mesenteric arterie og cøliaki stammen, for at forhindre lækage, og indsætte en fire-millimeter arterioty kanyle i den anden ende af aorta. Dernæst placere bugspytkirtlen i orgelkammeret, og forbinde kanylen i bugspytkirtlen til en mandlig Luer. Derefter, gennemgafle bugspytkirtlen med opløsning tre i en time ved 20 milliliter i minuttet, og fryse dobbelt-perfunderes bugspytkirtlen på minus 20 grader Celsius i løsning fire indtil starten af decellularization.

På dagen for at starte decellularisering, tø bugspytkirtlen ved fire grader Celsius, og placere optøet bugspytkirtel i decellularization organ kammer. Tilslut vaskemiddel indløbsrør til aorta i bugspytkirtlen, og vask bugspytkirtlen med opløsning tre ved 20 milliliter i minuttet natten over ved fire grader Celsius. Den næste morgen, dekantere enhver opløsning tilbage i orgelkammeret, og gennemgå bugspytkirtlen i 30 minutter ved 20 milliliter i minuttet i opløsning fem ved fire grader Celsius.

Ved afslutningen af opløsningen fem perfusion, perfem i bugspytkirtlen i otte timer ved 20 milliliter i minuttet i opløsning seks og fire grader Celsius, efterfulgt af en 96-timers vask i frisk opløsning fem ved 20 milliliter i minuttet og fire grader Celsius. Udskift vasken med 500 milliliter DPBS suppleret med calcium og magnesium i 30 minutter ved 37 grader Celsius, efterfulgt af perfusion med 250 milliliter opløsning syv i fire timer ved 20 milliliter i minuttet og 37 grader Celsius. Derefter vaskes orglet i yderligere 120 timer med frisk opløsning fem ved 20 milliliter i minuttet og fire grader Celsius, og opbevar orglet i opløsning otte.

Her, brutto morfologi af en normal bugspytkirtel, som vises lys pink og indeholder milt, forbindelse, og duodenal lapper, kan observeres. Efter decellularisering, den lyserøde farve er tabt, og den forarbejdede bugspytkirtel vises bleg hvid i farven. I en normal bugspytkirtel, mange blå kerner er synlige ved H og E farvning, mens der i en decellulære bugspytkirtel kerner ikke længere kan visualiseres, bekræfter deres tab.

Den isolerede intakte svinecelle bugspytkirtel, efter denne procedure, det vil give en komplet perfusion og vellykket decellularization samtidig bevare strukturen og også tillade nogle ekstracellulære matrix proteiner, der skal opnås. Den decellulariserede bugspytkirtel kan bruges til at udvikle hel-organ recellularization strategier i bioreaktor systemer med relevante celletyper. Efter recellularization med modtageren stamceller, væv manipuleret bugspytkirtlen kan anvendes til kliniske anvendelser og test af lægemidler.

Glem ikke, at arbejde med Triton X-100 og SDC kan være yderst farligt, og at forholdsregler, såsom at bære handsker og forberede løsninger under røghætte, bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

X

Simple Hit Counter