الدراسة المتزامنة لتجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق في الأنابيب

لهذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال الالتهاب وعلم المناعة. على سبيل المثال، ما هي الآلية الجزيئية للتصاق الكريات البيض والهجرة عبر البطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتمييز الاستخدام غير المحدود بين الهجرة والإضافة القوية للوحديات الأحادية إلى الطبقات الأحادية البطانية.

على الرغم من أن هذه الطريقة توفر معلومات حول تجنيد أحاديات على تدفق، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف مع خلايا أخرى من أنظمة الدم مثل الخلايا التائية، B-الخلايا، أو مشتقات من السكان الفرعية منها. بعد الغسيل، وتسمية الخلايا endothelial الوريدي السري الإنسان أو HUVEC مع 30 ميكرولترات من 37 درجة مئوية M199 المتوسطة تكملها واحدة CMFDA micromolar لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مع 150 ميكرولترات من M199 المتوسطة كاملة واحتضان الثقافة في 150 ميكرولترات من M199 جديدة كاملة المتوسطة لمدة 30 دقيقة أخرى.

ثم استبدال المافق بـ 150 ميكرولترات كاملة من M199 المتوسطة الكاملة التي تحتوي على المكملات التجريبية المناسبة وتعيد ثقافة غرفة الشريحة إلى الحاضنة لمدة ست ساعات. بالنسبة لعزلة أحادية PAN البشرية ، قم بتخفيف عينة دم تم جمعها حديثًا في PBS تكملها EDTA واحدة من الملليمولار بنسبة واحدة إلى واحدة وطبقة 20 مل بعناية من محلول الدم على 20 مل من متوسط التدرج الكثافة لفصل التدرج الكثافة عن طريق الطرد المركزي. جمع الطبقة المتوسطة صفائح الصفائح الدموية أحادية النواة الدموية في أنبوب جديد 50 مل تحتوي على 40 مل من برنامج تلفزيوني تكملها EDTA 1 ميليمولار وإحضار الحجم النهائي إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني إضافي-EDTA بعد عد، عزل أحادية مع مجموعة العزلة أحادية لعموم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

وغسل الخلايا ثلاث مرات في M199 المتوسطة تكمل مع 0.5٪ البوم الدم البقري، أو BSA، للقضاء على أي آثار EDTA. إن جودة العزل أحادية الانسداد أمر بالغ الأهمية لضمان الهجرة القوية ونتيجة الالتصاق. وبالتالي فمن المهم أن تتبع بدقة توصية الشركة المصنعة لعزل.

Resuspend بيليه في 6 مرات 10 إلى 6 أحادية لكل مل تركيز في M199 المتوسطة الطازجة تكمل مع 0.5٪ BSA وتقسيم الخلايا إلى واحد 200 ميكرولتر aliquot لكل microcentrifuge أنبوب في عملية التوظيف. ثم ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل حقنها في غرفة التدفق. لإعداد النظام fluidic للتحليل، أولاً إدراج موصل luer الذكور في نهاية واحدة من 8 سم طويلة 3 مم سميكة قطعة من أنابيب السيليكون وربط الطرف الآخر إلى مجموعة حقن luer مضمنة.

ثم قم بتوصيل موصل luer إلى نهاية واحدة من قطعة 3 مم سميكة 3 سم طويلة من أنابيب السيليكون. بعد ذلك، حقنة 20 ملم إلى نهاية واحدة من 1 متر طويلة 3mm سميكة قطعة من أنابيب السيليكون وإدراج موصل luer الذكور إلى الطرف الآخر. ثم إدراج كل من الذكور وصلات luer في 1111 luer قفل الإناث ومينسر وضع نهاية حرة من أنابيب السيليكون في خزان من 37 درجة مئوية M199 المتوسطة تكمل مع 0.5٪ BSA.

سحب المكبس لملء الأنابيب مع تدفق العازلة وتأمين حقنة على مضخة الحقنة. ثم قم بتعيين المضخة إلى وضع السحب وتحديد معدل التدفق. لتوصيل غرفة الشريحة، المشبك أنابيب السيليكون حول الرابط قفل luer الإناث وقطع الاتصال الذكور موصل luer اثنين من من مربط للسماح لهم أن تكون متصلا إلى خزان الشريحة.

فقاعات الهواء لا تعكر صفو جودة الصورة فحسب، بل تحفز أيضاً الإجهاد الشعري الهائل للخلايا، مما يؤدي إلى موت الخلايا. لتجنب فقاعات الهواء، تأكد من لقط الصحيح من الأنابيب قبل إدراج luer في الخزان. ثم إزالة المشابك للتأكد من أن الاتصال لا تسرب ووضع الشريحة تحت المجهر.

لتصوير التوظيف أحادية تحت التدفق، إضافة 5 ميكرولترات من الأجسام المضادة لـ CD16 الدقيق وصبغة نووية مناسبة لكل أحادية aliquoted لمدة 10 دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة وجمع الخلايا مع الطرد المركزي وجيزة. Resuspend بيليه في 250 ميكرولترات من تدفق العازلة وبدء ضخ حقنة. إضافة 30 ميكروليتر من تعليق أحادية واحدة إلى غرفة واحدة من الشريحة واختيار الهدف 40X على المجهر confocal.

تفعيل الليزر الفلورسنت المناسبة واستخدام الغرفة مع monocyte المسمى لتعيين المعلمات اقتناء المجهر confocal التالي، حدد ثلاثة حقول الرؤية ضمن نصف قطر نصف سنتيمتر للتصوير confocal موقف متعدد، وتعيين كومة Z إلى نطاق 10 إلى 12 ميكرومتر والاستيلاء على الفاصل الزمني لتشغيل كل دقيقة واحدة. بعد ثلاث دقائق من التصوير، قم بحقن 200 ميكروليترات من الخلايا الأحادية من خلال منفذ حقن luer المضمن والبدء في تصوير التفاعل الخلوي. بعد 30 دقيقة على الأقل، قم بإيقاف التصوير والتدفق وتضييق الأنبوب للسماح بفصله عن الشريحة.

لتحديد معدل الهجرة عبر الخلايا من خلال HUVECs حفز، فتح صورة J وعدد العدد الإجمالي من أحادية الملتم المتصّب في كل حقل لتحديد عدد الخلايا لكل ملليمتر مربع. ثم عد عدد من monocytes transmigrated الموجودة في الطائرة القاعدية تحت الخلايا البطانية كما حددت من خلال وجود منطقة ثقب أسود حول النواة. وهناك طريقة بسيطة للتحقق من حالة التنشيط من HUVECs بعد التحفيز هو التصور من الإطالة بهم تحت الضغط الالتهابي.

يسمح التصوير confocal الفاصل الزمني التصور من أحادية في الطائرة apical حيث يمكن تقييم النمط الظاهري. تنتقل الخلايا المهاجرة التي تمر بمرحلة هجرة إلى تقاطع الخلايا بين الخلايا قبل أن تختفي من الطائرة الأولية وتظهر من جديد في الطائرة القاعدية. إن كمية التوظيف أحادية الانسداد مع مرور الوقت تؤكد أن الالتصاق أحادية الانسة يتبعه هجرة عابرة.

معدل الهجرة من أحادية إيجابية CD16 منخفض عندما يتم تحفيز الخلية البطانية مع TNF ألفا فقط ولكن يزيد عندما يتم تحفيز الخلايا البطانية مع كل من TNF ألفا وعامل النمو البطانية الوعائية أو VEGFA. تحفيز HUVEC مع TNF ألفا و TNF ألفا بالإضافة إلى VEGFA يحفز زيادة في الالتزام بالخلايا T وB وNK السلبية CD14، مقارنة بالخلايا أحادية CD14 إيجابية. بالإضافة إلى ذلك، يحفز التحفيز HUVEC هجرة السكان أحادية الانسة فقط، حيث أن الخلايا T و B و NK لا تُحول تحت إما TNF alpha أو TNF alpha بالإضافة إلى الظروف التحفيزية VEGFA.

لإجراء اختبار التوظيف الأحادي الأمثل، من المهم أن تخطط للتجربة مقدمًا وأن تفعل ذلك في نفس اليوم. وعند تنقية الخلايا، تأكد من أن المجهر الخاص بك هو في 37 درجة بحيث لا تنقل الخلايا إلى درجة حرارة مختلفة أثناء التجربة. لمعرفة هذا الإجراء، يمكن تنفيذ جميع الطرق مثل التنميط من هيفيك السيتوكين والتعبير chemokine وكذلك دراسات chemotaxis للإجابة على سؤال إضافي حول الآلية الجزيئية التي تحافظ على الهجرة والتصاق سكان أحادية معينة.