Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Växternas tillväxt och Agrobacterium-medierad Floral-dip omvandlingen av den Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary January 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Agrobacterium-medierad omvandling med en blommig-dip metod kan användas framgångsrikt att skapa stabila transgena linjerna av extremophyte modell Schrenkiella parvula. Vi presenterar ett protokoll ändras från det för Arabidopsis thaliana, med tanke på olika tillväxt vanor och fysiologiska egenskaper av extremophyte.
Transcript
Denna metod, ett reproducerbart transformationsprotokoll för Schrenkiella parvula, kan hjälpa till att besvara frågor inom området växtjäm jämförande och funktionell genoming, särskilt studier som undersöker växtanpassningar till tuffa miljöer. Denna teknik möjliggör undersökningar av rutinfunktioner i Schrenkiella parvula på extremophyten anpassad till multi-jon salt påfrestningar. Det möjliggör också jämförande studier som också tittar på dess nära släkting, moderföräldern Aribidopsis Thaliana.
Jämföra Schrenkiella Parvula med Aribidopsis Thaliana kan ge insikt i varianser i genreglering och funktion som möjliggör en unik anpassning av Schrenkiella parvula. Transformationsprotokollet för Arabidopsis Thaliana har redan varit väletablerat. Metoden möjliggör nu jämförande studier med hjälp av transgena Schrenkiella Parvula-växter.
Generellt forskare nya till denna metod kommer att kämpa på grund av blommande vana och blad morfologi Schrenkiella Parvula växter som gör effektiv omvandling med hjälp av en flora dopp samt urval av sanna transformanter svårt. Till att börja med använda en våt tandpetare för att överföra ca 20 till 25 S.Parvula frön på våt jord. Sedan stratifiera fröna vid fyra grader celsius i fem till sju dagar.
Efter stratifiering, returnera fröna till tillväxtkammaren i sju till 10 dagar. När alla plantor har grodda, lämna bara en planta i var och en av de fyra hörnen och i mitten av krukorna. Odla växterna i åtta till 10 veckor i tillväxtkammaren tills de blommar.
På dagen för omvandlingen väljer S.Parvula växter enligt textprotokollet. Använd tok och små saxar för att ta bort eventuella pollinerade blomställningar som redan utvecklas till siliques. Efter växter är redo, förbereda en agrobacterium infiltrationslösning.
Efter detta, doppa S.Parvula blomställning i agrobacterium infiltrationslösning i 20 sekunder. Visas här är det tidigaste skedet av de växter som kan användas för omvandling, så länge som redan utvecklade siliques avlägsnas före omvandling, äldre växter med fler blommor kan användas. Efter omvandlingen, placera blomma doppade växter horisontellt i rena brickor med kupoler för att täcka växterna.
Placera sedan växterna i ett mörkt tillväxtrum i en till två dagar. Återför plantorna till upprätt läge och överför dem till tillväxtrummet. Under den följande veckan, övervaka de doppade blomställningarna.
Tio dagar efter den första blommiga dopp, S.Parvula växter kommer att fortsätta producera nya blomställningar och siliques. En andra omgång av blommig dopp kan utföras för att ytterligare omvandla den nyligen framväxande blomställningar. Odla växterna tills frön mognar, och skörda fröna runt 21 veckor.
Torka fröna i två till tre veckor i rumstemperatur i en lufttät behållare fylld med torkmedel. Plantera T en frö enligt textprotokollet. Odla växterna tills de två första till tre sanna bladen utvecklas.
För att utföra det första urvalet för herbicidresistens, späd glufosinat ammonium herbicid och spraya det på plantorna. Täck plantorna med kupolerna över natten. Sätt tillbaka brickorna till tillväxtrummet, och ta bort kupolen.
Vänta tills de flesta av plantorna är utvalda ut av herbiciden. För att börja det andra urvalet, identifiera de växter som överlever efter att ha sprutats tre till fyra gånger med BASTA-lösningen. Efter odling av växterna i två till tre veckor, välj den största mogna blad på varje planta.
Nästa gnugga ytan av bladet försiktigt med ett finger för att ta bort vaxskiktet. Placera sedan en droppe av den utspädda BASTA-lösningen på bladet. Övervaka bladen som behandlats med BASTA-lösningen för tecken på vissning i upp till en vecka.
Välj slutligen växterna med lämnar opåverkat av BASTAEN tappar för mer ytterligare analys. I detta protokoll förvandlades S.Parvula med agrobacterium med en floral dip-metod. Infektion med agrobacterium resulterade i abort av vissa blommor.
Emellertid fortsatte S.Parvulaväxterna för att jordbruksprodukter nya blommor efter den första blommadoppningen, och kunde omformas igen. Med hjälp av TESTerna FÖR SPRAY och släpp av BASTA kan sanna positiva transformanter identifieras exakt. Antalet prov som testats med hjälp av PCR-bekräftelse kan minskas.
Medan denna metod liknar omvandlingen av Arabidopsis Thaliana, är det viktigt att komma ihåg skillnaderna i tillväxt och morfologi av Schrenkiella Parvula. Att ändra protokollet så att det återspeglar dessa skillnader är avgörande för framgångsrik omvandling. Denna teknik kan hjälpa forskare att utforska utvecklingen av genomiska variationer som leder till flera salt stress anpassningar i extremophyte modellen, Schrenkiella Parvula.
Att kombinera denna teknik med informationen om funktionerna hos Aradopsis Thaliana, en annan växt nära besläktad med Schrenkiella Parvula. Forskare kan studera variationerna i regleringen och funktioner som dessa är två distinkta strukturer mellan dessa två arter. Under omvandlingsprocessen är det viktigt att innehålla alla agrobacterium infiltrationslösning i autoklaverbara behållare.
Sterilisera och säkert kasta alla material som kom i kontakt med agrobacterium inklusive handskar, makropipettspetsar och hushållspapper.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
