Biology
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可视化和跟踪活果蝇黑色素细胞卵室的内源性 mRNA
Chapters
Summary June 4th, 2019
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在这里,我们提出了一个协议,用于可视化,检测,分析和跟踪内源性mRNA贩运在活的果蝇黑色素细胞卵室使用分子信标,旋转盘共聚焦显微镜,和开源分析软件。
Transcript
该方法有助于回答RNA生物学领域有关极化RNA定位机制和功能的关键问题。该技术的主要优点是，它允许实时可视化活组织内源性RNA贩运。该技术的影响延伸到RNA相关疾病的治疗，因为它有可能发现新的治疗靶点。
虽然这种方法可以提供对果蝇蛋室RNA过程的洞察，但它也可以应用于其他系统，如斑马鱼或培养细胞。一般来说，由于分子信标道具的设计和交付带来的挑战，新方法的个体将难以克服。对于分子信标微注射，选择 40 倍油目标，并在显微镜舞台上安装带解剖蛋室的盖玻片。
找到一个卵室在中后期发育阶段，是适当的定向微注射。然后设置具有适当注射和补偿压力的微注射器。使用微型操纵器操纵手柄，轻轻将装有一微升分子信标溶液的针头放入油滴中。
将尖端聚焦到视场的外围。执行清洁功能，从针尖上去除空气，并确保针头流出，并将针头带到家中位置。聚焦蛋室进行微注射，使针头回到蛋室边缘附近的焦点。
对目标的 z 位置进行微调，使分离毛囊细胞与护士细胞的膜处于焦点位置。将针头插入护士细胞，在两到五秒内注射分子信标。为确保可重复的微注射成功，请仔细关注分离毛囊细胞和将注射的护士细胞的膜，同时将针头尖与微操纵器聚焦。
当所有分子信标都注射后，轻轻取出针头并将其缩回家中位置。将目标更改为所需的放大倍率以进行图像采集。然后专注于新目标的蛋室，开始图像采集。
要对分子信标进行现场检测，请打开图像 J 中的图像，使用转换为 ICY 工具将图像转换回 ICY。比例杆将自动覆盖到堆栈上。必要时通过检查器窗口编辑比例线。
然后停用图层选项卡下比例栏的眼部图标，从原始堆栈中删除比例条。选择检测和跟踪、检测和现场检测器，并分别为输入和预处理参数选择电流序列输入检测和通道零。对于探测器，选择检测暗背景上的亮点，使用强制使用 2D 波长进行 3D 时，只有在堆栈中没有足够的 z 切片来执行分析时。
为每个比例选择比例和灵敏度，为较大的点添加更多比例，并确认序列中感兴趣的区域已设置为感兴趣区域。对于筛选，请确认未设置筛选，并在输出下选择适当的文件格式。如果要将现场检测结果用于跟踪分析，请选择导出到游泳池。
对于同化分析，重复其他通道的点检测。要跟踪分子信标点，请选择检测和跟踪、跟踪、点跟踪，并使用与点检测相同的参数运行点探测器。单击估计参数，并在参数估计弹出窗口中选择所需的目标运动。
然后单击"运行跟踪"。要可视化轨道，请选择检测和跟踪、跟踪和跟踪管理器。对于颜色轨道处理器，选择启用并选择轨道的颜色。
从添加轨道处理器，选择轨道处理器时间剪辑。在检查剪子窗口中，输入当前时间点之前和之后要显示的检测数。将轨道信息另存为 XML 跟踪文件，并使用相机图标获取结果的屏幕截图。
要沿 z 方向投影堆栈，请使用搜索栏查找插件，然后从下拉菜单中选择最大投影。在检查器窗口中，选择序列选项卡、画布和旋转以将图像调整到所需方向，并获取旋转图像的屏幕截图。然后选择感兴趣区域、2D 感兴趣区域，选择感兴趣区域形状，并在图像上选择感兴趣区域进行裁剪。
安装时间戳叠加插件，并按照弹出窗口中的说明添加时间戳，以了解如何放置和格式化时间戳。若要更改或添加时间间隔，请单击序列属性窗口中的编辑。激活眼睛图标以在检查器窗口中的图层选项卡下添加比例条。
然后获取时间戳结果的屏幕截图，并同时以 TIFF 和 AVI 格式保存图像。使用这种方法，如所证明的，可以可视化内源mRNA的传输和定位模式，通过分子信标在不同阶段的卵巢生成，特别是在中生生。当单独注射到同一阶段的蛋室时，不同的奥斯卡特异性分子信标呈现相同的定位模式。
注入护士细胞细胞的分子信标将自由扩散到相邻的护士细胞中以及卵巢细胞中。因此，信标能够与目标混合，并在微注射场址以外的其他地点生成荧光信号。在oskar GFP转基因蛋室中，采集数据的分析表明，基因工程GFP标记的oskar mRNA的荧光信号与使用分子信标检测的荧光信号具有广泛的结肠化。
此外，5D堆栈可以进一步分析，以确定oskar mRNA轨迹，用于在护士细胞和卵母细胞细胞质的长距离传输。该技术开发后，为RNA生物学领域的研究人员探索果蝇卵室的内源性母体mRNA的运输和定位铺平了道路。
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