Biology
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Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo
Chapters
Summary June 4th, 2019
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Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.
Transcript
Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de biologia do RNA sobre o mecanismo e a função da localização polarizada do RNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização em tempo real do tráfico endógeno de RNA em tecidos vivos. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia de doenças relacionadas ao RNA porque tem potencial para descobrir novos alvos terapêuticos.
Embora este método possa fornecer insights sobre os processos de RNA na câmara de ovos de mosca-das-frutas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como em zebrafish ou células culturais. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão por causa dos desafios associados ao projeto e à entrega dos adereços de farol molecular. Para microinjeção de farol molecular, selecione o objetivo do óleo 40X e monte uma mancha de cobertura com a câmara de ovo dissecada no estágio do microscópio.
Localize uma câmara de ovos no estágio de desenvolvimento médio e tardio que seja adequadamente orientada para microinjeção. Em seguida, configure um microinjetor com as pressões de injeção e compensação apropriadas. Usando o joystick micro manipulador, abaixe suavemente uma agulha carregada com um microliter de solução de farol molecular na gota de óleo.
Coloque a ponta em foco para a periferia do campo de visão. Execute uma função limpa para remover o ar da ponta da agulha e garantir que haja fluxo da agulha e leve a agulha para a posição de casa. Concentre-se na câmara de ovos para ser microinjetada e traga a agulha de volta ao foco perto da borda da câmara de ovos.
Realize um ajuste fino da posição z do objetivo de modo que a membrana que separa as células folículos das células enfermeiras esteja em foco. Insira a agulha em uma célula enfermeira para injeção dos faróis moleculares durante um período de dois a cinco segundos. Para garantir o sucesso da microinjeção reprodutível, concentre-se cuidadosamente na membrana que separa as células folículos e as células enfermeiras que serão injetadas ao colocar a ponta da agulha em foco com o micro manipulador.
Quando todos os faróis moleculares tiverem sido injetados, remova suavemente a agulha e retraia-a para a posição de casa. Alterar o objetivo para a ampliação desejada para aquisição de imagens. Em seguida, concentre-se na câmara de ovos sob o novo objetivo e comece a aquisição de imagem.
Para detecção pontual dos faróis moleculares, abra as imagens na imagem J.Use a ferramenta converter para ICY para converter as imagens de volta ao ICY. Uma barra de escala será automaticamente sobreposta na pilha. Edite a barra de escala através da janela do inspetor, conforme necessário.
Em seguida, inativar o ícone ocular da barra de escala sob a guia de camada para remover a barra de escala da pilha original. Selecione detecção e rastreamento, detecção e detector de manchas e confirme a detecção de entrada de sequência atual e o canal zero são selecionados para os parâmetros de entrada e pré-processamento, respectivamente. Para detector, selecione detectar ponto brilhante sobre fundo escuro usando o uso de força de comprimentos de onda 2D para 3D somente se não houver fatias z suficientes nas pilhas para realizar a análise.
Selecione escalas e sensibilidade para cada escala adicionando mais escalas para pontos maiores e confirme que a região de interesse da sequência é definida para região de interesse. Para filtragem, confirme se nenhuma filtragem foi definida e selecione o formato de arquivo apropriado sob saída. Se os resultados do detector de manchas forem usados para análise de rastreamento, selecione exportar para piscina.
Para análise de colocalização, repita a detecção do ponto para o outro canal. Para rastrear os pontos do farol molecular, selecione detecção e rastreamento, rastreamento, rastreamento de manchas e execute o detector de manchas usando os mesmos parâmetros da detecção do local. Clique em parâmetros de estimativa e selecione o movimento de destino desejado na janela popup de estimativa de parâmetros.
Em seguida, clique em executar o rastreamento. Para visualizar as faixas, selecione detecção e rastreamento, rastreamento e gerenciador de faixas. Para o processador de faixa de cores, selecione ativar e selecionar uma cor para as faixas.
A partir de adicionar processador de faixa, selecione o clipe de tempo do processador de faixa. Na janela do cortador de verificação, digite o número de detecções a serem mostradas antes e depois do ponto de tempo atual. Salve as informações da faixa como um arquivo de faixa XML e use o ícone da câmera para obter uma captura de tela dos resultados.
Para projetar a pilha ao longo da direção z, use a barra de pesquisa para encontrar o plugin e selecione a projeção máxima no menu suspenso. Na janela do inspetor, selecione a guia de sequência, tela e rotação para ajustar a imagem à orientação desejada e obter uma captura de tela da imagem rotativa. Em seguida, selecione região de interesse, região de interesse 2D, escolha região de forma de interesse e selecione a região de interesse na imagem para cultivo.
Instale o plugin de sobreposição de datamp e adicione um data-hora seguindo as instruções na janela pop-up para obter instruções sobre como colocar e formatar o estamp de tempo. Para alterar ou adicionar o intervalo de tempo, clique em editar na janela de propriedades sequência. Ative o ícone dos olhos para adicionar de volta a barra de escala sob a guia de camada na janela do inspetor.
Em seguida, obtenha uma captura de tela dos resultados carimbados e salve a imagem nos formatos TIFF e AVI. Usando este método como demonstrado, é possível visualizar os padrões de transporte e localização de mRNAs endógenos através de balizas moleculares em vários estágios da oogênese e, em particular, na e depois da oogênese média. Quando injetados individualmente nas mesmas câmaras de ovos de estágio, diferentes faróis moleculares específicos de Oskar apresentam o mesmo padrão de localização.
Os faróis moleculares injetados no citoplasma de uma célula enfermeira difundirão livremente em células enfermeiras adjacentes, bem como no oócito. Assim, os faróis são capazes de hibridizar com seus alvos e gerar sinais de fluorescência em outros locais além do local de microinjeção. Nas câmaras de ovos transgênicos oskar GFP em média oogênese, a análise dos dados de aquisição mostra uma colocalização extensiva para o sinal de fluorescência de GFP geneticamente modificado com o sinal de fluorescência detectado usando sinalizadores moleculares.
Além disso, as pilhas 5D podem ser analisadas para determinar as trajetórias de oskar mRNA para transporte de longa distância tanto em células enfermeiras quanto em citoplasma oocito. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biologia do RNA explorarem o transporte e a localização do mRNA materno endógeno na câmara de ovos Drosophila.
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