Biology
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Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers
Chapters
Summary June 4th, 2019
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Ici, nous présentons un protocole pour la visualisation, la détection, l'analyse et le suivi du trafic endogène d'ARNm dans la chambre d'oeufs de Melasophila melanogaster vivante utilisant des balises moléculaires, la microscopie confocale de disque spinning, et l'analyse open-source logiciel.
Transcript
Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie de l’ARN sur le mécanisme et la fonction de localisation polarisée de l’ARN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la visualisation en temps réel du trafic d’ARN endogène dans les tissus vivants. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie des maladies liées à l’ARN parce qu’elle a un potentiel pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des processus d’ARN dans la chambre d’oeufs de mouche des fruits, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que dans le poisson zèbre ou les cellules de culture. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal en raison des défis associés à la conception et la livraison des accessoires de balise moléculaire. Pour la microinjection moléculaire de balise, sélectionnez l’objectif d’huile de 40X et montez un coverslip avec la chambre disséquée d’oeuf sur l’étape de microscope.
Localisez une chambre d’oeufs au stade de développement moyen à tardif qui est correctement orientée pour la microinjection. Ensuite, installez un microinjecteur avec les pressions d’injection et de compensation appropriées. À l’aide du joystick du micro manipulateur, abaissez doucement une aiguille chargée d’un microlitre de solution de balise moléculaire dans la chute d’huile.
Concentrez la pointe vers la périphérie du champ de vision. Exécutez une fonction propre pour enlever l’air de la pointe de l’aiguille et pour s’assurer qu’il y a écoulement de l’aiguille et amener l’aiguille à la position de la maison. Concentrez-vous sur la chambre d’œuf à microinjecter et remettre l’aiguille au point près du bord de la chambre d’oeufs.
Effectuer un ajustement fin de la position z de l’objectif de sorte que la membrane séparant les cellules follicules des cellules infirmières est au point. Insérez l’aiguille dans une cellule d’infirmière pour l’injection des balises moléculaires sur une période de deux à cinq secondes. Pour assurer le succès reproductible de la microinjection, concentrez-vous soigneusement sur la membrane séparant les cellules follicules et les cellules infirmières qui seront injectées tout en mettant la pointe de l’aiguille au point avec le micro manipulateur.
Lorsque toutes les balises moléculaires ont été injectées, retirez doucement l’aiguille et rétractez-la à la position de la maison. Modifiez l’objectif au grossissement souhaité pour l’acquisition d’images. Ensuite, concentrez-vous sur la chambre d’oeufs sous le nouvel objectif et commencer l’acquisition de l’image.
Pour la détection ponctuelle des balises moléculaires, ouvrez les images dans Image J.Utilisez l’outil convertir en ICY pour convertir les images en ICY. Une barre d’échelle sera automatiquement superposée sur la pile. Modifiez la barre d’échelle par l’intermédiaire de la fenêtre de l’inspecteur si nécessaire.
Inactivez ensuite l’icône de l’œil pour la barre d’échelle sous l’onglet couche pour supprimer la barre d’échelle de la pile d’origine. Sélectionnez détection et suivi, détection et détecteur de taches, et confirmez que la détection d’entrée de séquence actuelle et le canal zéro sont sélectionnés pour les paramètres d’entrée et de prétraitement respectivement. Pour le détecteur, sélectionnez détecter les taches brillantes sur fond sombre en utilisant l’utilisation de la force des longueurs d’onde 2D pour la 3D seulement s’il n’y a pas assez de tranches z dans les piles pour effectuer l’analyse.
Sélectionnez les échelles et la sensibilité pour chaque échelle en ajoutant plus d’échelles pour les taches plus grandes et confirmez que la région d’intérêt de la séquence est définie pour la région d’intérêt. Pour le filtrage, confirmez qu’aucun filtrage n’a été défini et sélectionnez le format de fichier approprié sous sortie. Si les résultats du détecteur de taches doivent être utilisés pour l’analyse de suivi, sélectionnez l’exportation vers la piscine.
Pour l’analyse de colocalisation, répétez la détection ponctuelle pour l’autre canal. Pour suivre les balises moléculaires, sélectionnez la détection et le suivi, le suivi, le suivi des taches et exécutez le détecteur de taches en utilisant les mêmes paramètres que pour la détection ponctuelle. Cliquez sur les paramètres d’estimation et sélectionnez le mouvement cible désiré dans la fenêtre popup d’estimation des paramètres.
Cliquez ensuite sur exécuter le suivi. Pour visualiser les pistes, sélectionnez détection et suivi, suivi et gestionnaire de piste. Pour le processeur de piste couleur, sélectionnez activer et sélectionner une couleur pour les pistes.
À partir d’ajouter le processeur de voie, sélectionnez le clip de temps de processeur de voie. Dans la fenêtre clipper de vérification, entrez le nombre de détections à montrer avant et après le point de temps actuel. Enregistrez les informations de la piste en tant que fichier de piste XML et utilisez l’icône de la caméra pour obtenir une capture d’écran des résultats.
Pour projeter la pile le long de la direction z, utilisez la barre de recherche pour trouver le plugin et sélectionnez la projection maximale du menu dropdown. Dans la fenêtre de l’inspecteur, sélectionnez l’onglet séquence, la toile et la rotation pour ajuster l’image à l’orientation désirée et obtenir une capture d’écran de l’image tournée. Sélectionnez ensuite la région d’intérêt, la région d’intérêt 2D, choisissez la forme de la région d’intérêt et sélectionnez la région d’intérêt sur l’image à recadrage.
Installez le plugin de superposition timestamp et ajoutez une lampe de temps suivant les instructions dans la fenêtre contextup pour les directions sur la façon de placer et de formater la lampe à temps. Pour modifier ou ajouter l’intervalle de temps, cliquez sur modifier la fenêtre propriétés de séquence. Activez l’icône de l’œil pour rajouter la barre d’échelle sous l’onglet couche dans la fenêtre de l’inspecteur.
Ensuite, obtenez une capture d’écran des résultats timestamped et enregistrer l’image dans les deux formats TIFF et AVI. En utilisant cette méthode comme démontré, il est possible de visualiser les schémas de transport et de localisation des ARNH endogènes par l’intermédiaire de balises moléculaires à différents stades de l’œogenèse et en particulier à l’oogenèse moyenne et après. Lorsqu’elles sont injectées individuellement dans les mêmes chambres d’oeufs de stade, différentes balises moléculaires spécifiques à l’oskar présentent le même modèle de localisation.
Les balises moléculaires injectées dans le cytoplasme d’une cellule infirmière se diffusent librement dans les cellules infirmières adjacentes ainsi que dans l’ovocyte. Ainsi, les balises sont capables de s’hybrider avec leurs cibles et de générer des signaux de fluorescence à d’autres sites que le site de microinjection. Dans les chambres d’oeufs transgéniques oskar GFP au milieu de l’oogenèse, l’analyse des données d’acquisition montre une colocalisation étendue pour le signal de fluorescence de l’ARNm oskar marqué oskar génétiquement modifié avec le signal de fluorescence détecté à l’aide de balises moléculaires.
En outre, les piles 5D peuvent être analysées plus en détail pour déterminer les trajectoires de l’ARNm oskar pour le transport à longue distance dans le cytoplasme des cellules infirmières et des ovocytes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN pour explorer le transport endogène de l’ARNm maternel et la localisation dans la chambre d’oeufs de Drosophila.
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