Visualisering og sporing endogene mRNAs i live Drosophila melanogaster egg Chambers

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i RNA biologi feltet om mekanismen og funksjonen av polarisert RNA lokalisering. Den største fordelen med denne teknikken er at det gir mulighet for sanntidsvisualisering av endogene RNA-smugling i levende vev. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot behandling av RNA-relaterte sykdommer fordi den har potensial til å avdekke nye terapeutiske mål.

Selv om denne metoden kan gi innsikt i RNA-prosesser i fruktflueeggkammeret, kan den også brukes på andre systemer som i sebrafisk eller kulturceller. Generelt vil personer som er nye på denne metoden slite på grunn av utfordringene knyttet til design og levering av molekylære beacon rekvisitter. For molekylær beacon mikroinjeksjon, velg 40X olje mål og montere en coverslip med dissekert egg kammer på mikroskopet scenen.

Finn et eggkammer i midten til sen utviklingsstadiet som er riktig orientert for mikroinjeksjon. Sett deretter opp en mikroinjektor med riktig injeksjons- og kompensasjonstrykk. Bruk mikromanipulatorens joystick, senk forsiktig en nål lastet med en mikroliter molekylær beacon løsning inn i oljedråpen.

Sett spissen i fokus mot periferien av synsfeltet. Utfør en ren funksjon for å fjerne luften fra nålespissen og for å sikre at det strømmer fra nålen og bringe nålen til hjemmeposisjon. Fokuser på eggkammeret som skal mikroinjiseres og ta nålen tilbake i fokus nær kanten av eggkammeret.

Utfør en fin justering av z-posisjonen til målet slik at membranen som skiller follikkelcellene fra sykepleiercellene er i fokus. Sett nålen inn i en sykepleiercelle for injeksjon av molekylære beacons over en periode på to til fem sekunder. For å sikre reproduserbar mikroinjeksjon suksess, fokuser forsiktig på membranen som skiller follikkelcellene og sykepleiercellene som skal injiseres mens du bringer spissen av nålen i fokus med mikromanipulatoren.

Når alle molekylære beacons har blitt injisert, fjern forsiktig nålen og trekk den tilbake til hjemmeposisjonen. Endre målet til ønsket forstørrelse for bildeanskaffelse. Deretter fokuserer du på eggkammeret under det nye målet og begynner bildeoppkjøpet.

For spotdeteksjon av molekylære beacons, åpne bildene i Bilde J.Bruk konverter til ICY-verktøyet for å konvertere bildene tilbake til ICY. En skaleringslinje legges automatisk over på stabelen. Rediger skalalinjen via inspektørvinduet etter behov.

Deretter deaktiverer du øyeikonet for skalalinjen under lagfanen for å fjerne skalalinjen fra den opprinnelige bunken. Velg deteksjons- og sporings-, deteksjons- og spotdetektor, og bekreft at gjeldende sekvensinngangsdeteksjon og kanal null er valgt for henholdsvis inndata- og forhåndsprosesseringsparameterne. For detektor velger du å oppdage lyspunkt over mørk bakgrunn ved hjelp av kraftbruk av 2D-bølgelengder for 3D bare hvis det ikke er nok z-skiver i stablene til å utføre analysen.

Velg vekter og følsomhet for hver skala som legger til flere vekter for større flekker, og bekreft at interesseområde fra sekvens er angitt for interesseområde. For filtrering, bekreft at ingen filtrering er angitt, og velg riktig filformat under utdata. Hvis spotdetektorresultatene skal brukes til sporingsanalyse, velger du Eksporter til svømmebasseng.

Gjenta spotgjenkjenningen for den andre kanalen for kolokaliseringsanalyse. Hvis du vil spore molekylære beacon-flekker, velger du gjenkjenning og sporing, sporing, spotsporing og kjører spotdetektoren ved hjelp av de samme parametrene som for spotdeteksjonen. Klikk på estimatparametere, og velg ønsket målbevegelse i popup-vinduet for parameterestimering.

Klikk deretter kjør sporing. Hvis du vil visualisere sporene, velger du gjenkjenning og sporing, sporing og sporbehandling. For fargesporprosessor velger du Aktiver og velger en farge for sporene.

Velg tidsklipp for sporprosessor på Legg til sporprosessor. I kontrollklippervinduet angir du antall deteksjoner som skal vises før og etter gjeldende tidspunkt. Lagre sporinformasjonen som en XML-sporfil, og bruk kameraikonet til å få et skjermbilde av resultatene.

Hvis du vil projisere stakken langs z-retningen, bruker du søkefeltet til å finne programtillegget og velger maksimal projeksjon fra rullegardinmenyen. I inspektørvinduet velger du sekvensfanen, lerretet og rotasjonen for å justere bildet til ønsket retning og få et skjermbilde av det roterte bildet. Velg deretter interesseområde, 2D-interesseområde, velg interesseområdefigur og velg interesseområdet på bildet for beskjæring.

Installer programtillegget for tidsstempel og legg til et tidsstempel ved å følge instruksjonene i popup-vinduet for veibeskrivelser om hvordan du plasserer og formaterer tidsstempelet. Hvis du vil endre eller legge til tidsintervallet, klikker du rediger i vinduet sekvensegenskaper. Aktiver øyeikonet for å legge til skaleringslinjen under lagfanen i inspektørvinduet.

Deretter får du et skjermbilde av de tidsstemplede resultatene og lagrer bildet i både TIFF- og AVI-formater. Ved hjelp av denne metoden som demonstrert, er det mulig å visualisere transport- og lokaliseringsmønstrene til endogene mRNAer via molekylære beacons på ulike stadier av oogenese og spesielt ved og etter midogenese. Når individuelt injisert i samme stadium egg kamre, ulike oskar spesifikke molekylære beacons presentere samme mønster for lokalisering.

Molekylære beacons injisert i cytoplasma av en sykepleier celle vil fritt diffuse i tilstøtende sykepleier celler så vel som inn i oocyte. Dermed er beacons i stand til å hybridisere med sine mål og generere fluorescens signaler på andre steder enn mikroinjeksjon nettstedet. I oskar GFP transgene eggkamre ved midten avogenese viser analyse av oppkjøpsdataene omfattende colocalization for fluorescenssignalet til genmodifisert GFP merket oskar mRNA med fluorescenssignalet oppdaget ved hjelp av molekylære beacons.

Videre kan 5D-stabler analyseres videre for å bestemme oskar mRNA baner for langdistansetransport i både sykepleiercelle og oocyte cytoplasma. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen RNA-biologi for å utforske endogene mors mRNA transport og lokalisering i Drosophila eggkammer.