Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Direkte Intratekal injektion af rekombinant Adeno-associeret virus i voksen mus
Chapters
Summary February 15th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en direkte Intratekal injektionsteknik bruger 1% lidocain hydrochlorid i en viral løsning at sikre effektiv adeno-associeret virus levering til små dyr og indføre et pointsystem for at forudsige transduktion effektivitet i centralt nervesystemet forhold til graden af forbigående svaghed induceret af lidocain.
Transcript
Denne metode letter en effektiv intrathecal levering af adeno-associerede virale transgener i vågne små dyr til eksperimentel behandling af centralnervesystemet sygdomme som ALS. Den største fordel ved denne metode er, at den virale opløsning omfatter 1% lidocainhydrorid, som fremkalder en forbigående lammelse efter en vellykket injektion. Selv om denne metode giver en visuel indikator for at bedømme succes en intrathecal automatiseret situation, tilstrækkelig praksis er afgørende for at forbedre succesraten for levering.
Før proceduren påbegyndes, fastgøres en 27 gauge-nål til en 25 mikroliter Hamilton-sprøjte, og den skrå spids af nålen justeres med den volumetriske skala på sprøjten. Læg derefter forsigtigt 8 mikroliter på 4 x 10 til 10th genomkopier af virusopløsningen i sprøjten, idet der skalved være bobler. Dernæst placere en vågen 30 til 70 dage gamle 12 til 30 gram mus på en seng stykke i den udsatte position i en biosikkerhed hætte og dække overkroppen med sterile gaze til at berolige musen og for at undgå at blive bidt.
Fast greb musen på sin bækken bælte med tommelfingeren på den ene side og pegefinger og langfinger på den anden side holde huden mellem den bilaterale bækken hofteholdere stram med en tommelfinger og pegefinger. Barber derefter pelsen mellem de bilaterale bækkenholdere og sterilisere den eksponerede hud med en jod baseret krat og 70% ethanol. Ved direkte intrathecal levering af adeno-associeret virusopløsning skal det intervertebrale rum palpere det intervertebrale rum langs midterlinjen mellem de bilaterale bækkenholdere og bruge en fingernegl til at trykke en indrykning ind i huden for at angive L5 til L6 intervertebralt rum.
Drej bunden af halen lidt og forsigtigt at afsløre midterlinjen af rygsøjlen og justere facet af nålen mod hovedet af dyret. Når musen er fast fastgjort, justeres nålen langs rygsøjlens midterlinje, og nålen sættes forsigtigt og lodret ind i midten af indrykningen, så sprøjten holdes i et centralt sagittalplan. Når nålen kommer i kontakt med knoglen, langsomt mindske vinklen til ca 30 grader og slip nålen ind i intervertebrale rum.
En pludselig hale svirp er et tegn på en vellykket indrejse i intradural rum. Når nålen kommer ind i intervertebrale rum, vil spidsen føle sig fastspændt. Indsprøjt vektoropløsningen, og hold nålen i det intradurale rum i et minut.
Træk derefter langsomt nålen tilbage med rotation for at minimere lækage. Umiddelbart score den forbigående svaghed af musen lemmer til at vurdere injektion kvalitet og returnere musen til sit bur for inddrivelse fra lammelse. Ved det relevante eksperimentelle endepunkt fastgør lemmerne og hovedet af den injicerede mus i udsat position på et skumæsedæksel, og brug en saks til at fjerne og fjerne huden fra hovedet til korsbenet.
Klip kraniet mellem øjnene, skåret langs midterlinjen af kraniet og den vandrette linje over lillehjernen og åbne kraniet på hver side. Brug pincet til at fjerne occipital knoglen og bruge oftalmologiske saks til at åbne rygmarvskanalen bilateralt. Skær ribbenene på begge sider og fjern forsigtigt den øverste del af ryghvirvler.
Brug buede pincet til at løfte hjernen og afskære nerverne i kraniet base. Derefter forsigtigt udtrække hele hjernen og rygmarven og fastsætte væv i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Ved afslutningen af fikseringsperioden, kryobeskytte hjernen og livmoderhalskræft og lænde rygmarv i 30% saccharose opløsning natten over ved 4 grader Celsius efterfulgt af indlejring i optimal skæretemperatur sammensatte før snap frysning i flydende nitrogen.
Brug derefter en kryostat til at opnå 25 mikrometer tykke dele af hvert væv, opbevaring af de frosne sektioner i 0,01 molar PBS ved 4 grader Celsius, som de er opnået. For immunhisemisk analyse af vævene forbehandles de fritflydende sektioner med 1 %hydrogenperoxid i 10 minutter efterfulgt af en 10 minutters vask i PBS. Derefter inkuberes prøverne i blokerende opløsning, der indeholder 5%serum og 0,3%nonionisk vaskemiddel i PBS i 1 time efterfulgt af natten mærkning ved 4 grader Celsius med passende primære antistoffer af interesse.
Den næste dag vaskes sektionerne med 3 10 minutters vask i PBS plus Tween, og rutsjebanerne inkuberes med de relevante tilsvarende biotinylerede sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time efter den sidste vask. Ved inkubationens afslutning vaskes afsnittene 3 gange i frisk PBST som blot påvist og inkuberes prøverne med infinity biotinperoxidasekompleks i 40 minutter efterfulgt af farvning med et passende krogent middel. Monter de mærkede sektioner på glasmikroskopdias og læg diasene i vandfri ethanol i blød i 5 minutter, når de monterede sektioner er helt tørret.
Næste sættetid dias i xylen i 10 minutter og forsegle dem med en passende montering medium. Derefter billede dias med et lys mikroskop udstyret med en ladning koblet enhed på 100, 200 og 400 gange forstørrelser. eGFP immunostaining af cervikal og lumbal rygmarvsvæv sektioner afslører ringe eller ingen transduktion i lænde rygmarven af mus med en svaghed score på 0, lidt forbedret transduktion i mus med en svaghed score på 1, og stærke og udbredte transduktioner i mus med en svaghed score på 4 eller 5.
Kvantificering af GFP farvning intensiteten af rygmarvsvæv sektioner fra mus viser forskellige grader af forbigående lemmer svaghed indikerer, at sværhedsgraden af svaghed efter virusopløsning injektion nøje korrelerer med omfanget af rygmarvstransduktion. I hjernen, robust eGFP signaler påvises i olfaktoriske pære, dorsolateral præfrontal cortex, dentate gyrus, og CA3 zone af hippocampus, cerebellar cortex, og marginale områder af hjernestammen, herunder ansigtskerne, choroid plexus, og ependymal epitelceller. Motor neuroner i den forreste horn er også stærkt transduced i forskellige niveauer af rygmarven.
Desuden, i cortex, GFP positive neuroner, herunder pyramideceller påvises samt forskellige glia celletyper, herunder mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytter. Denne teknik gør det muligt for forskere på neurologi området til at udforske de terapeutiske virkninger af direkte intrathecal levering i små vågne dyr på centralnervesystemet sygdomme.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
