Biology
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Ein BW-Reporter-System für das Studium-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen
Chapters
Summary January 7th, 2019
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Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Reporter-System zu etablieren, die verwendet werden können, zu identifizieren und zu quantifizieren-Rezeptor-Ligand-Interaktionen.
Transcript
Shalom.Das BW Reporter System ermöglicht es, Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu untersuchen. Es ist äußerst nützlich in Fällen, in denen der Liganden eines bestimmten Rezeptors unbekannt ist oder in Fällen, in denen die Experimente mit dem endogenen Ligand technisch schwierig sind. Diese Methode ist empfindlich und spezifisch für einen individuellen Rezeptor, einfach zu bedienen und reproduzierbar.
Demonstriert wird das Verfahren von Shira Kahlon, einem Postdoc für mein Labor. Am Tag vor der Transfektion Platten 10 Platten mit 10 Millilitern von 100, 000 BW5147 Zellen, und ergänzen sie ein RPMI. Dann 100 Mikrogramm des pcDNA3-Plasmids in eine Röhre geben.
Natriumacetat bei pH 5,3 in das Rohr geben. Danach 2,5 Volumen von 100% Ethanol in das Plasmidgemisch geben. Dann die Plasmidmischung über Nacht bei minus 20 Grad Celsius inkubieren.
24 Stunden nach der Beschichtung der BW-Zellen, sammeln Sie die Zellen in zwei 50-Milliliter-Röhren. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 515 g für fünf Minuten, und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Peloton RPMI ohne Ergänzungen aus und wiederholen Sie die Zentrifugation.
Setzen Sie das resultierende Pellet in 1 Milliliter RPMI ohne Zusätze aus. Das resuspendierte Pellet auf Eis auf 4 Zentimeter Zulauf geben. Zentrifugieren Sie das Plasmid, das Ethanol ausfällt.
Dann waschen Sie das Plasmid mit einem Milliliter 70% Ethanol. Und die Zentrifugation für weitere 20 Minuten wiederholen. Entfernen Sie das gesamte Ethanol und lassen Sie das Pellet teilweise trocknen.
Dann setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter vorgeheiztem RPMI wieder auf, ohne Zusätze. Danach fügen Sie das resuspendierte Plasmid zu den Zellen in Cuvet hinzu. Die Zellen fünf Minuten lang auf Eis bebrüten.
Als nächstes elektroporate die Zellen. Dann übertragen Sie die elektropolierten Zellen in ein 50-Milliliter-Rohr. Fügen Sie 50 Milliliter komplettes Medium in das Rohr und zentrifugieren für fünf Minuten, bei 515 g.s.
Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 50 Milliliter des gesamten Mediums wieder aus. Dann die Zellen in 24-Well-Kultur-Gerichte teller, und inkubieren die Zellen für 48 Stunden. Danach, fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium, ergänzt mit 10 Milligramm pro Milliliter G418 zu jedem Brunnen.
48 Stunden später einen Milliliter des oberen Volumens jedes Brunnens entsorgen. Dann fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium mit fünf Milligramm pro Milliliter G418 zu jedem Brunnen ergänzt. Verwenden Sie 50.000 transfizierte BW-Zellen mit ihren gewünschten Zielen, in einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Platte für 48 Stunden. Dann gefrieren Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius. Beschichten Sie eine ELISA-Platte mit Anti-Maus IL-2 Antikörper.
Legen Sie 05 Mikrogramm Anti-Maus IL-2, in einem Volumen von 50 Mikroliter PBS in jedem Brunnen. Die beschichtete Platte über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten. Verwenden Sie eine kurze Inkubationszeit bei 37 Grad Celsius, um die gefrorenen BW-Zellen aufzutauen, die zuvor mit ihren Zielen inkubiert wurden.
Dann zentrifugieren Sie die Platte und übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstandes von jedem Brunnen auf die vorbeschichtete ELISA-Platte. Und bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden brüten. Danach Biotin Anti-Maus IL-2 auf die ELISA-Platte geben.
Dann nach der Inkubation und waschen, HRP konjugierte stur Streptavidin auf den Teller hinzufügen. Nach dem Inkubieren und Waschen 100 Mikroliter der TMB-Substratlösung in jeden Brunnen der ELISA-Platte geben. Lesen Sie schließlich die ELISA-Platte bei 650 Nanometern.
In diesem Beispiel wurden CLL-Zellen mit verschiedenen Anti-CD20-Antikörpern vorinstalliert. Und dann mit transfizierten BW-Zellen ko-inkubiert, die die Fc-Rezeptoren CD16 ausdrücken, bevor sie mit ELISA analysiert werden. Nach der Analyse mit ELISA wurden die Ergebnisse quantifiziert.
Die optischen Dichteniveaus wurden basierend auf der Standardkurve in Maus-IL-2-Konzentrationen umgewandelt. In einem zusätzlichen Experiment wurden verschiedene Dosen von Anti-CD20-Antikörpern mit CLL-Zellen vorinkubiert. Und dann mit den transfizierten BW-Zellen inkubiert.
Das Teilchen enthält vier Hauptteile. Klonen, Transfektion von BW-Zellen, Aktivierung und ELISA. Jedes der Teile sollte unabhängig überprüft werden.
Nach diesem Verfahren können zusätzliche Experimente mit Zellen durchgeführt werden, die die endogene Rezeptoren exprimieren, wie z. B. das Töten von Säuren mit NK-Zellen, um Wechselwirkungen mit NK-Zellrezeptoren zu untersuchen. Wir haben dieses System verwendet, um neue Liganden von NK-Zellrezeptoren zu entdecken. Zum Beispiel ist Hemagglutinin ein Liganden von NKp46, und PVL ist ein Liganden von TG.
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