Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Effekten af fluorescerende proteiner på Fusion partnere ved hjælp af polyglutamin toksicitet Assays i gær
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikel beskriver protokoller for at vurdere effekten af fluorescerende proteiner på en sammenlægning og toksicitet af fejlfoldede polyglutamin udvidelse til hurtig evaluering af en nyligt uncharacterized fluorescerende proteiner inden for rammerne af fluorescerende journalister.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for fluorescerende proteiner såsom hvordan fluorescerende proteiner kan påvirke deres fusion partnere. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en hurtig og let skalerbar vurdering af virkningerne af fluorescerende proteiner og deres fusion partnere. Selv om denne metode kan give indsigt i fluorescerende protein adfærd, det kan også anvendes til andre genetisk kodede tags.
Også demonstrere denne procedure vil være Sonja Di Gregorio, der er en kandidatstuderende ved Western University. Hvert fluorescerende protein, der testes ved denne metode, klones først ind i en gærekspressionsvektor, der koder en galakosefremkaldende version af FLAG-mærket HTT exon one huser enten den ikke-giftige 25Q-gentagelse eller den huntingtons sygdom, der er forbundet med giftig 72Q-gentagelse. Kloner udvælges og verificeres ved sekvensering og omdannes efterfølgende til gær.
For at forberede cellekulturer til de forskellige analyser, streak gær kloner bærer 25Q eller 72Q tag med en fluorescens protein af interesse på en agar plade, der indeholder gær udvælgelse medium med glukose som kulstofkilde. Samtidig, streak gær bærer 25Q eller 72Q gær optimeret monomerisk superfolder GFP til at tjene som en positiv kontrol. Inkuber pladerne ved 30 grader Celsius i to til tre dage.
Vælg op til de tre enkelte kolonier fra hver plade og inokuler fem milliliter syntetisk komplet medium suppleret med 2% glukose som kulstofkilde. Inkuber kulturerne ved 30 grader Celsius natten over. Den følgende dag overføres 200 mikroliter af hver nattens kultur til et mikrocentrifugerør og centrifuge til pellet cellerne.
Vask mindst tre gange med sterilt destilleret vand. Det er vigtigt at vaske cellerne godt for at fjerne alle spor af glukose, der kan bidrage til at undertrykke induktion af GAL1 promotor. Forbered cellerne som vist tidligere, og re-suspendere dem i syntetisk komplet medium, der indeholder 2%galactose som kulstofkilde til at fremkalde udtryk for polyQ fusioner.
Som en kontrol, re-suspendere cellerne i glukose-holdige medier. Inkuber cellerne ved 30 grader Celsius i et rør rotator natten over. Den følgende morgen måles den optiske tæthed ved 600 nanometer for hver kultur ved hjælp af et spektrofotometer.
Udligne celletætheden til en optisk tæthed 600 af 2 ud af 100 mikroliter syntetisk komplet medium i en steril 96-brøndplade. Forbered fire femfoldige fortyndinger af hver prøve ved at pipettere 20 mikroliter af prøven fra det foregående brønd i 80 mikroliter af medier i den næste brønd. Brug en gær pinning værktøj til at spotte cellerne på selektive plader og inkubere ved 30 grader Celsius i to dage.
Billede pladerne med en billeddokumentationenhed. Forbered cellekulturerne til denne analyse, og mål derefter OD600 for hver kultur ved hjælp af et spektrofotometer. Cellerne fortyndes til en OD600 på 1 ud af 300 mikroliter af medier i 96-brøndpladen.
Forbered hver prøve i tre eksemplarer. Inkuber pladen i en pladelæser inkubator med rysteevner. Sæt antallet af prøver, temperaturen ved 30 grader Celsius, absorbansen ved 600 nanometer, længden af forsøgene til 24 timer, og målingen intervaller til 15 minutter.
Vælg den kontinuerlige rystetilstand. Når eksperimentet er gjort, skal du oprette vækstkurven og kvantificere området under kurven ved hjælp af videnskabelig grafsoftware. Indsæt dataene i en XY-tabel med tre replikerede værdier.
Vækstkurven vises under grafmappen i venstre side. Hvis du vil kvantificere området under kurven, skal du vælge Analysér øverst til venstre og klikke område under kurve i XY-analyser. Start denne procedure ved at fortynde de forberedte celler 10 gange i vækstmedium.
Overfør 200 mikroliter af hver prøve til et otte-brøndbilledkammer. Billede cellerne ved hjælp af en standard wide-field fluorescerende mikroskop. Juster billedindstillingerne for billedopkøb.
Da 72Q aggregater er meget lysere end den diffuserede 25Q signal, er det ofte nødvendigt at bruge en anden erhvervelse indstilling mellem de forskellige plasmider for at undgå mætning af fluorescerende signal. Bearbejde billederne ved hjælp af en passende billedbehandlingssoftware. I denne protokol bruges dot blot til at undersøge proteinudfoldelsesniveauer.
Forbered bufferen til generering af proteinlysater ved at tilføje fire mikromolar phenylmethylsulfonylfluorid og en proteasehæmmercocktail til lysisbufferen. Pellet fem milliliter af hver natten kultur ved centrifugering. Re-suspendere cellerne i 200 mikroliter af glasperler og 200 mikroliter af lysis buffer.
Vortex i 30 sekunder for 12 runder, glasur i mellem runder. Centrifuge på 12, 000 gange G ved fire grader Celsius i 10 minutter og indsamle supernatant. Brug et mikrofiltreringsapparat til at spotte lige store mængder totalprotein på en nitrocellulosemembran.
Fordæt membranen med PBS og saml apparatet. Tilslut den til en vakuumkilde, og sørg for, at skruerne er strammet. Læg prøverne, tænd for vakuum, og lad prøven filtrere gennem membranen ved tyngdekraften.
Blot membranen i PBS 05%Tween 5% fedtfri mælk i 30 minutter. Inkuber membranen med primær anti-flag antistof ved fire grader Celsius natten over. Den følgende dag vaskes membranen tre gange i 10 minutter hver med PBS 05% Tween.
Inkuber membranen med et fluorescerende mærket sekundært antistof i PBS 05% Tween 5% fedtfri mælk ved stuetemperatur i en time. Membranen vaskes tre gange i 10 minutter hver med PBS 05% Tween. Derefter billede membranen ved hjælp af en aminosving dokumentationssystem.
Gær udtrykker enten 25Q eller 72Q HTT exon en smeltet til gær optimeret monomerisk superfolder GFP eller gær optimeret monomeriske tag BFP2 blev dyrket i glukose eller galactose medium natten over og enten spottet på agar plader eller inkuberet yderligere i flydende medier. Mens 72Q gær optimeret monomerisk superfolder GFP inducerer en betydelig vækst defekt. 72Q gær optimeret monomeric tag BFP2 viser en vækst fænotype svarende til de ikke-giftige 25Q modstykker angiver, at arten af fluorescerende tag kan hindre polyQ ekspansion adfærd i celler.
Vurdering af sammenlægning af fluorescerende polyQ fusioner ved fluorescerende mikroskopi viser, at 72Q gær optimeret monomerisk superfolder GFP viser signifikant aggregering, mens 72Q gær optimeret monomerisk tag BFP2 viser en diffus cytoplasmic signal ligner de ikke-giftige 25Q modstykker. Da ekspressionsniveauer af de forskellige polyQ fusioner kan påvirke toksicitet, dot blots blev udført for at vurdere proteinniveauer. Resultater fra femfoldige fortyndinger af cellerelysater vises.
Glem ikke, at denne teknik giver mulighed for hurtig sammenligning af ukarakteriserede og fluorescerende proteiner med GFP varianter, men det kan ikke direkte vurdere oligomerization. Efter denne procedure, andre foranstaltninger, for eksempel, såranalyse i pattedyr celler kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål såsom monomeriske status af fluorescerende proteiner.
Tags
Biologi sag 141 fluorescerende proteiner polyglutamin toksicitet gær vækst assays sammenlægning grøn fluorescerende proteiner fluorescerende mikroskopiRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
