Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Effekten av fluorescerande proteiner på Fusion Partners använder Polyglutamine toxicitet analyser i jäst
Chapters
Summary November 28th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denna artikel beskriver protokoll för att bedöma effekten av fluorescerande proteiner om sammanläggning och toxicitet av felveckning polyglutamine expansion för snabb utvärdering av en nyligen uncharacterized fluorescerande protein inom ramen av fluorescerande reportrar.
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom fluorescerande proteiner som hur fluorescerande proteiner kan påverka deras fusionspartner. Den största fördelen med denna teknik är att den ger en snabb och lätt skalbar bedömning av effekterna av de fluorescerande proteinerna och deras fusionspartners. Även om denna metod kan ge insikt i fluorescerande protein beteende, det kan också tillämpas på andra genetiskt kodade taggar.
Också visar detta förfarande kommer att Sonja Di Gregorio, som är en doktorand vid Western University. Varje fluorescerande protein som testas med denna metod klonas först till en jästuttrycksvektor som kodar en galaktosinducerbar version av FLAG-taggad HTT exon en som hyser antingen den giftfria 25Q-upprepningen eller Huntington-sjukdomen som förknippas med toxisk 72Q-upprepning. Kloner väljs ut och verifieras genom sekvensering och därefter omvandlas till jäst.
För att förbereda cellkulturer för de olika analyserna, strimma jästen kloner redovisade 25Q eller 72Q tagg med en fluorescens protein av intresse på en agar platta som innehåller jäst urvalsmedium med glukos som kol källa. Samtidigt, strimma jäst bär 25Q eller 72Q jäst optimerade monomeriska superfolder GFP att fungera som en positiv kontroll. Inkubera plattorna i 30 grader Celsius i två till tre dagar.
Välj upp till de tre enstaka kolonierna från varje platta och inokulera fem milliliter syntetiskt komplett medium kompletterat med 2%glukos som kolkälla. Inkubera kulturerna vid 30 grader Celsius över natten. På följande dag, överföra 200 mikroliter av varje övernattning kultur till en microcentrifug röret och centrifug till pellet cellerna.
Tvätta minst tre gånger med sterilt destillerat vatten. Det är viktigt att tvätta cellerna väl för att eliminera alla spår av glukos som kan bidra till att undertrycka induktion av GAL1 promotorn. Förbered cellerna som visat tidigare och åter avbryta dem i syntetiska komplett medium som innehåller 2%galaktos som kolkälla för att inducera uttrycket av polyQ fusioner.
Som en kontroll, åter avbryta cellerna i glukos-innehållande media. Inkubera cellerna i 30 grader Celsius i en rörrotator över natten. På följande morgon, mäta den optiska densiteten vid 600 nanometer av varje kultur med hjälp av en spektrofotometer.
Utjämna cellen tätheter till en optisk densitet 600 av 2 i 100 mikroliter av syntetiska komplett medium i en steril 96-brunns platta. Förbered fyra femfaldiga utspädningar av varje prov genom pipettering av 20 mikroliter av provet från föregående brunn in i 80 mikroliter media i nästa brunn. Använd en jäst fästverktyg för att upptäcka cellerna på selektiva plattor och inkubera i 30 grader Celsius i två dagar.
Avbilda plattorna med en bilddokumentationsenhet. Förbered cellkulturerna för denna analys och mät sedan OD600 av varje odling med hjälp av en spektrofotometer. Späd cellerna till en OD600 av 1 i 300 mikroliter media i 96-brunnsplattan.
Förbered varje prov i tre exemplar. Inkubera plattan i en tallrik läsare inkubator med skakningar kapacitet. Ställ in antalet prover, temperaturen vid 30 grader Celsius, absorbansen vid 600 nanometer, experimentens längd till 24 timmar och mätintervallen till 15 minuter.
Välj det kontinuerliga skakningsläget. När experimentet är klart, skapa tillväxtkurvan och kvantifiera området under kurvan med hjälp av vetenskaplig grafprogramvara. Klistra in data i en XY-tabell med tre replikerande värden.
Tillväxtkurvan kommer att visas under grafmappen på vänster sida. Om du vill kvantifiera området under kurvan väljer du analysera längst upp till vänster och klickar på område under kurva i XY-analyser. Starta detta förfarande genom att späda ut de beredda cellerna 10-faldig i tillväxtmedium.
Överför 200 mikroliter av varje prov till en åtta-brunnsbildkammare. Avbilda cellerna med hjälp av ett vanligt wide-field fluorescerande mikroskop. Justera bildframställningsinställningarna för bildanskaffning.
Eftersom 72Q aggregat är mycket ljusare än den diffusa 25Q signalen, är det ofta krävs att använda en annan förvärv inställning mellan de olika plasmiderna för att undvika mättnad av fluorescerande signal. Bearbeta bilderna med hjälp av en lämplig bildbehandlingsprogramvara. I detta protokoll används dot blot för att undersöka proteinuttrycksnivåer.
Förbered bufferten för att generera protein lysates genom att tillsätta fyra mikromolar av fenylmetylsulfonylfluorid och en proteashämmare cocktail till lysbufferten. Pellet fem milliliter av varje övernattning kultur genom centrifugering. Re-suspend cellerna i 200 mikroliter av glaspärlor och 200 mikroliter av lysbuffert.
Vortex i 30 sekunder i 12 omgångar, isande i mellan omgångarna. Centrifugera vid 12, 000 gånger G vid fyra grader Celsius i 10 minuter och samla supernatanten. Använd en mikrofiltreringsapparat för att upptäcka lika stora mängder totalt protein på ett nitrocellulosamembran.
Förväta membranet med PBS och montera apparaten. Anslut den till en vakuumkälla och se till att skruvarna är åtdragna. Ladda proverna, slå på vakuumet och låt provet filtrera genom membranet genom tyngdkraften.
Blot membranet i PBS 05%Tween 5%fettfri mjölk i 30 minuter. Inkubera membranet med primär anti-flagga antikropp vid fyra grader Celsius över natten. På följande dag, tvätta membranet tre gånger i 10 minuter vardera med PBS 05%Tween.
Inkubera membranet med en fluorescerande märkt sekundär antikropp i PBS 05%Tween 5%fettfri mjölk i rumstemperatur i en timme. Tvätta membranet tre gånger i 10 minuter vardera med PBS 05%Tween. Därefter, bild membranet med hjälp av en amino blot dokumentationssystem.
Jäst uttrycker antingen 25Q eller 72Q HTT exon en smält till jäst optimerad monomeric superfolder GFP eller jäst optimerad monomeric tag BFP2 odlades i glukos eller galaktos medium över natten och antingen fläckig på agar plattor eller inkuberas ytterligare i flytande media. Medan 72Q jäst optimerad monomeric superfolder GFP inducerar en betydande tillväxt defekt. 72Q jäst optimerad monomerisk tagg BFP2 visar en tillväxt fenotyp som liknar de giftfria 25Q motsvarigheter som anger att arten av fluorescerande taggen kan hindra polyQ expansion beteende i celler.
Bedömning av aggregering av de fluorescerande polyQ fusioner genom fluorescerande mikroskopi visar att 72Q jäst optimerad monomeric superfolder GFP visar betydande aggregering, medan 72Q jäst optimerad monomerisk tagg BFP2 visar en diffus cytoplasmatisk signal som liknar de icke-toxiska 25Q motsvarigheter. Eftersom uttrycksnivåer av de olika polyQ-fusionerna kunde påverka toxiciteten utfördes dot blots för att bedöma proteinnivåer. Resultat från femfaldiga utspädningar av cellen lysates visas.
Glöm inte att denna teknik möjliggör snabb jämförelse av okarakteriserade och fluorescerande proteiner med GFP-varianterna, men den kan inte direkt bedöma oligomerisering. Efter detta förfarande kan andra åtgärder, till exempel, såranalysen i däggdjursceller utföras för att besvara ytterligare frågor som den monomeriska statusen för de fluorescerande proteinerna.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
