Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler
Chapters
Summary January 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikel illustrerer en kraftfuld metode til at anslå mitokondrier eller lysosomer i levende celler. Kombinationen af lysosomet eller mitokondrier specifikke farvestoffer med fluorescently konjugerede antistoffer mod celleoverflademarkører giver mulighed for kvantificering af disse organeller i blandet cellepopulationer, som primær celler høstet fra vævsprøver, ved hjælp af flerfarvet flowcytometri.
Transcript
Denne metode kan hjælpe os med at besvare centrale spørgsmål i immun-metabolisme området. Fordelen ved denne teknik er, at det giver mulighed for kvantificering af mitokondrier eller lysosomer i de enkelte levende celler, i en kompleks blanding af forskellige celletyper. Denne metode til at studere T- og B-celler kan også anvendes på mange andre celletyper såsom makrofager, dendritiske celler eller eventuelle primærceller, der er høstet fra en vævsprøve.
Proceduren vil blive demonstreret af Chin-Wen Wei, en kandidatstuderende fra mit laboratorium. For at mærke organellerne til kvantificering skal du først tilføje en gang ti til den sjette mus T-celler til et rundt bundfaxrør pr. markør. Og pellet cellerne ved centrifugering.
forvard til 37 grader Celsius serumfrit dyringsmedie for at fortynde de organellespecifikke sondebestandløsninger til de endelige arbejdskoncentrationer i mediet. Og re-suspendere cellerne i 100 mikroliter af sonde farvestof pr rør. Derefter inkuberes cellerne i en cellekulturinkubator i den relevante farvningsperiode, hvilket stopper reaktionen ved slutningen af inkubationen med en milliliter iskold faxbuffer pr. rør.
Derefter indsamles cellerne med en anden centrifugering og re-suspendere pellets i 100 mikroliter af den præ-titrerede 24G2 hybridoma supernatant på is. Efter ti minutter tilsættes en milliliter faxbuffer pr. rør. Cellerne opsamles ved centrifugering, og mærk cellerne med 50 mikroliter af den fortitrede fluorescenskonjugeret antistofcocktail af interesse.
Den relevante koncentration i henhold til tabellen. Og fax buffer i 20 minutter på is, beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning tilsættes en milliliter faxbuffer pr. rør.
Indsamle cellerne ved centrifugering. Og re-suspendere cellerne i 300 mikroliter af fax buffer suppleret med et mikrogram pr. milliliter propidium iodid. Umiddelbart efter tilføjelse af nukleare og kromosom counterstain, tænde flow cytometer analyse computer, flow cytometer, fax erhvervelse software, og andre tilbehør enheder afhængigt af maskinen platform.
Kør PBS gennem systemet i ca. et minut for at sikre, at flowlinjen er fyldt med PBS og hylsterbuffer. Åbn et nyt eksperiment, og angiv cytometerparametrene i henhold til producentens anvisninger. Cellerne filtreres gennem en 70 mikrometercelles si.
Og vortex forud for erhvervelsen af hver prøve for at undgå klumper og doublet formation. Åbn indstillingen Automatisk kompensation, og opret prikplots for hver fluorescerende parameter. Når alle spændingerne er indstillet, skal du justere kompensationen og anvende kompensationen på prøverne.
Opret en fremad scatter versus side scatter plot og optimere spændingerne, så cellerne af interesse vises i plottet. Opret en fremad scatter versus fremad scatter højde plot og gate de enkelte celler. Opret en fremad scatter område versus side scatter område plot og gate lymfocytter.
Opret en fremad scatter område versus propidium iodid plot og gate de levende celler. Når alle spændingerne er indstillet, skal du justere kompensationen og anvende kompensationen på prøverne. Derefter indlæses det første prøverør, der skal oprettes de relevante celleoverflademarkørområder, og der indsamles mindst 1.000 hændelser i den befolkning, der er af interesse.
Når alle prøverne er kørt, skal flowdataene eksporteres til efterfølgende analyse. Og gem eksperimentet som en skabelon for at bevare cytometerindstillingerne og parametrene for lignende eksperimenter i fremtiden. Endelige site mitokondrielt indhold er de laveste i dobbelt negative en T-celler, peak på dobbelt negative fase to og tre, og lidt fald i dobbelt negative fase fire.
Med dobbelt positive thymocytter demonstrere højere antal mitokondrier end CD4 og CD8 enkelt positive thymocytter, hvilket tyder på, at mitokondrielt indhold svinger under udviklingen. CD4 og CD8 enkelt positive thymocytter udviser en højere mitokondriel middelffluorescensintensitet end milt CD4 eller CD8 T-celler, hvilket tyder på, at naive T-celler, der recirkulation i det iltrige blodmiljø har en endnu lavere mitokondriel masse end thymocytter. Interessant, denne reduktion af mitokondrielt indhold er mere fremtrædende i CD8 end CD4 T celle afstamning, og T-celle aktivering yderligere nedsætter tilstedeværelsen af disse organeller.
Relativt lavt, men påviseligt, lysosomalt indhold er observeret i alle thymocyt populationer, med en mere fremtrædende tilstedeværelse i dobbelt negative en thymocytter. I periferien, et relativt højt antal lysosomer påvises i hukommelse og effektor CD8 positive T-celler. Ved at kombinere organelle specifikke farvestoffer og overflademarkør med flowcytometri er en effektiv måde at karakterisere cellernes metaboliske status på i en kompleks blanding.
Yderligere organelle specifikke farvestof kan bruges til at opdage endoplasmatisk reticulum, autophagic vakuol, eller andre intracellulære rum af interesse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
