Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Flerfarget flyt cytometri-baserte kvantifisering av mitokondrier og lysosomer i T-celler
Chapters
Summary January 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikkelen beskriver en kraftig metode for å kvantifisere mitokondrier eller lysosomer i levende celler. Kombinasjonen av lysosome - eller mitokondrier-spesifikk fargestoffer med fluorescently konjugert antistoffer mot overflate markører lar kvantifisering av disse organeller mikset-celle bestander, som primær celler høstet fra vevsprøver, ved hjelp av flerfarget flowcytometri.
Transcript
Denne metoden kan hjelpe oss med å svare på viktige spørsmål i immunmetabolismefeltet. Fordelen med denne teknikken er at den tillater kvantifisering av mitokondrier eller lysosomer i individuelle levende celler, i en kompleks blanding av forskjellige celletyper. Denne metoden for å studere T- og B-celler kan også brukes på mange andre celletyper som makrofager, dendrittiske celler eller noen primære celler høstet fra en vevsprøve.
Prosedyren vil bli demonstrert av Chin-Wen Wei, en utdannet student fra laboratoriet mitt. For å merke organeller for kvantifisering, først legge til en ganger ti til den sjette musen T-celler til en rund bunn faksrør per markør. Og pellet cellene ved sentrifugering.
forhåndsvarmet til 37 grader Celsius serumfri kultur medium for å fortynne organelle spesifikke sonde lager løsninger til endelige arbeidskonsentrasjoner i mediet. Og re-suspendere cellene i 100 mikroliter sonde fargestoff per rør. Deretter inkuberer cellene i en cellekulturinkubator for riktig fargingsperiode, og stopper reaksjonen på slutten av inkubasjonen med en milliliter iskald faksbuffer per rør.
Deretter samler cellene med en annen sentrifugering og re-suspendere pellets i 100 mikroliter av pre-titrert 24G2 hybridoma supernatant på is. Etter ti minutter legger du til én milliliter faksbuffer per rør. Samle cellene ved sentrifugering og merk cellene med 50 mikroliter av den forhåndstiterte fluorescenskonjugert antistoffcocktail av interesse.
Tilsett riktig konsentrasjon i henhold til tabellen. Og faksbuffer i 20 minutter på is, beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen legger du til én milliliter faksbuffer per rør.
Samle cellene ved sentrifugering. Og re-suspendere cellene i 300 mikroliter av faksbuffer supplert med ett mikrogram per milliliter propidiumjodid. Umiddelbart etter å ha lagt til kjernefysisk og kromosom motvirke, slå på strømmen cytometer analyse datamaskin, flyt cytometer, faks oppkjøp programvare, og andre tilbehør enheter avhengig av maskinen plattformen.
Kjør PBS gjennom systemet i omtrent ett minutt for å sikre at strømningslinjen er fylt med PBS og sheathe buffer. Åpne et nytt eksperiment og angi cytometerparametrene i henhold til produsentens instruksjoner. Filtrer cellene gjennom en 70 mikrometercellesil.
Og vortex før oppkjøpet av hver prøve for å unngå klumper og dobbeltformasjon. Åpne innstillingen For automatisk kompensasjon, og opprett punktplott for hver fluorescerende parameter. Etter at alle spenningene er innstilt, justerer du kompensasjonen og bruker kompensasjonen på prøvene.
Opprett en fremover scatter versus side scatter plot og optimalisere spenningene slik at cellene av interesse vises i plottet. Lag en fremover scatter versus fremover scatter høyde plott og gate enkeltcellene. Lag et fremoverspøtområde versus sidespøtområdeplott og gate lymfocytter.
Lag et spredt område fremover versus propidiumjodidplott og gate de levende cellene. Etter at alle spenningene er innstilt, justerer du kompensasjonen og bruker kompensasjonen på prøvene. Last deretter det første prøverøret, lag de riktige celleoverflatemarkørplottene, og samle minst 1000 hendelser av befolkningen av interesse.
Når alle prøvene er kjørt, eksporterer du flytdataene for senere analyse. Og lagre eksperimentet som en mal for å bevare cytometerinnstillingene og parametrene for lignende eksperimenter i fremtiden. Endelig sted mitokondrieinnhold er det laveste i dobbelt negativt en T-celler, topp på dobbel negativ stadium to og tre, og litt nedgang i dobbelt negativ stadium fire.
Med doble positive thymocytes som viser høyere antall mitokondrier enn CD4 og CD8 enkeltpositive tyrocytter, noe som tyder på at mitokondrieinnholdet svinger under utviklingen. CD4 og CD8 enkeltpositive tyrocytter viser en høyere mitokondrie gjennomsnittlig fluorescensintensitet enn milt CD4- eller CD8 T-celler, noe som tyder på at naive T-celler som resirkulerer i det oksygenrike blodmiljøet har en enda lavere mitokondriemasse enn tymocytter. Interessant, denne reduksjonen av mitokondrieinnhold er mer fremtredende i CD8 enn CD4 T celle avstamning, og T celle aktivering reduserer ytterligere tilstedeværelsen av disse organeller.
Relativt lavt, men påviselig, lysosomalt innhold observeres i alle thymocyte populasjoner, med en mer fremtredende tilstedeværelse i doble negative thymocytes. I periferien oppdages et relativt høyt antall lysosomer i minne og effekteller CD8 positive T-celler. Kombinere organelle spesifikke fargestoffer og overflatemarkør med strømningscytometri er en kraftig måte å karakterisere metabolsk status for celler i en kompleks blanding.
Ekstra organellespesifikt fargestoff kan brukes til å oppdage endoplasmatisk reticulum, autophagic vacuole eller andre intracellulære rom av interesse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
