Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي
Chapters
Summary January 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
توضح هذه المقالة طريقة قوية تحديد حجم الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في الخلايا الحية. مزيج الأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي ضد علامات السطح يسمح التحديد الكمي لهذه العضيات في الخلايا المختلطة السكان، مثل الخلايا الابتدائية تحصد من عينات الأنسجة، باستخدام قياس التدفق متعدد الألوان.
Transcript
يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأيض المناعي. وميزة هذه التقنية هي أنها تسمح بالتكون الكمي للميتوكوندريا أو الليسوسومات في الخلايا الحية الفردية ، في خليط معقد من أنواع الخلايا المختلفة. يمكن أيضاً تطبيق هذه الطريقة لدراسة الخلايا T و B على العديد من أنواع الخلايا الأخرى مثل الضامة أو الخلايا التكجرية أو أي خلايا أساسية يتم حصادها من عينة الأنسجة.
سيتم إثبات هذا الإجراء من قبل شين وين وي، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لتسمية العضيات لتحديد كمي، أولا، إضافة واحد × عشرة إلى الخلايا T الماوس السادس إلى واحد جولة أسفل أنبوب الفاكس لكل علامة. وبليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
تدفئة ما قبل إلى 37 درجة مئوية مصل خالية من ثقافة المتوسطة لتمييع حلول الأسهم مسبار محدد إلى تركيزات العمل النهائية في المتوسط. وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولترات من صبغة التحقيق لكل أنبوب. المقبل، احتضان الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لفترة تلطيخ المناسبة، ووقف رد فعل في نهاية الحضانة مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة فاكس عازلة لكل أنبوب.
ثم، وجمع الخلايا مع طرد مركز آخر وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من ما قبل titrated 24G2 الهجين سوبرنات على الجليد. بعد عشر دقائق، أضف ملليلتر واحد من مخزن الفاكس المؤقت لكل أنبوب. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتسمية الخلايا مع 50 ميكرولترات من الفلوروسين مترافق قبل titrated كوكتيل من الفائدة.
إضافة التركيز المناسب وفقا للجدول. و فاكس عازل لمدة 20 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من عازلة الفاكس لكل أنبوب.
جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من عازلة الفاكس تستكمل مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من يوديد بروبديسيوم. مباشرة بعد إضافة الصبغي النووي ومضادة الصبغي، بدوره على جهاز الكمبيوتر تحليل مقياس التدفق، تدفق cytometer، الفاكس اقتناء البرمجيات، وأية أجهزة ملحق أخرى اعتمادا على منصة الجهاز.
تشغيل برنامج تلفزيوني من خلال النظام لمدة دقيقة واحدة تقريبا لضمان أن يتم تعبئة خط التدفق مع برنامج تلفزيوني وتجدد العازلة. افتح تجربة جديدة واضبط معلمات مقياس المقاييس وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70.
ودوامة قبل الحصول على كل عينة لتجنب كتل وتشكيل مزدوج. افتح إعداد التعويض التلقائي، ثم قم بإنشاء مخططات نقطة لكل معلمة فلورية. بعد كل من الفولتية قد تم تعيين، وضبط التعويض وتطبيق التعويض على العينات.
إنشاء مبعثر إلى الأمام مقابل الجانب مؤامرة مبعثر وتحسين الفولتية بحيث تظهر خلايا الفائدة داخل المؤامرة. إنشاء مبعثر للأمام مقابل رسم ارتفاع مبعثر إلى الأمام وبوابة الخلايا المفردة. إنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل مخطط منطقة التشتت الجانبي وبوابة الخلايا الليمفاوية.
إنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل مؤامرة يوديد بروبديدوم وبوابة الخلايا الحية. بعد كل من الفولتية قد تم تعيين، وضبط التعويض وتطبيق التعويض على العينات. ثم قم بتحميل أنبوب العينة الأول، وقم بإنشاء مخططات علامة سطح الخلية المناسبة، وجمع ما لا يقل عن 1000 حدث من السكان موضع الاهتمام.
عند تشغيل كافة العينات، تصدير بيانات التدفق للتحليل اللاحق. وحفظ التجربة كقالب للحفاظ على إعدادات مقياس المعطيات والمعلمات لتجارب مماثلة في المستقبل. محتويات الموقع النهائي الميتوكوندريا هي أدنى في الخلايا T واحد سلبية مزدوجة، ذروة في المرحلة السلبية المزدوجة اثنين وثلاثة، وانخفاض طفيف في المرحلة السلبية المزدوجة الرابعة.
مع ضعف إيجابية ثيموسيتيات تظهر أعدادا أعلى من الميتوكوندريا من CD4 و CD8 thymocytes إيجابية واحدة, مما يشير إلى أن محتويات الميتوكوندريا تتقلب أثناء التنمية. CD4 وD8 thymocytes إيجابية واحدة المعرض أعلى كثافة متوسط الميتوكوندريا الفلورانس من الخلايا CD4 أو CD8 T Splenic، مما يشير إلى أن الخلايا التائية الساذجة التي تعيد تدويرها في بيئة الدم الغنية بالأكسجين لديها كتلة الميتوكوندريا أقل من الخلايا الدرقية. ومن المثير للاهتمام، وهذا التخفيض من محتويات الميتوكوندريا هو أكثر بروزا في CD8 من سلالة الخلايا T CD4، وتنشيط الخلية T يقلل من وجود هذه العضيات.
ويلاحظ انخفاض نسبيا، ولكن يمكن الكشف عنها، محتويات الليسوسومية في جميع السكان thymocyte، مع وجود أكثر بروزا في سلبية مزدوجة thymocytes واحد. في المحيط، يتم الكشف عن عدد كبير نسبيا من lysosomes في الذاكرة والمفعم CD8 الخلايا T إيجابية. الجمع بين الأصباغ العضوية محددة وعلامة سطح مع تدفق cytometry هو وسيلة قوية لتوصيف الحالة الأيضية للخلايا في خليط معقد.
ويمكن استخدام صبغة خاصة إضافية من العضية للكشف عن التشنج endoplasmic، وvacuole الأوتوفجية، أو غيرها من المقصورة داخل الخلايا من الفائدة.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
