Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss
Chapters
Summary February 22nd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett elegant protokoll för i vivo utvärdering av vaccin effektivitet och värd immunsvar. Detta protokoll kan anpassas för vaccin-modeller som studerar virala, bakteriella, eller parasitic patogener.
Transcript
Protokollet möjliggör utvärdering av värdsvar på en mängd olika patogener och vaccinformuleringar. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör utvärdering av bakteriebörda och immunsvar in vivo, med hjälp av en tractable djurmodell. Visar denna procedur är Kacy Yount, en doktorand från mitt laboratorium.
För immunisering, bekräfta en brist på svar på tå nypa i en sövd, sex till tolv veckor gammal mus, och ladda en en milliliter insulinspruta, utrustad med en 28,5 gauge nål med en 0,1 milliliter av vaccinet av intresse. Håll sprutan i 45 graders vinkel, med avfasningen uppåt, för in nålen cirka fem millimeter i musens deltoid och injicera vaccinet. Håll nålen insatt i muskeln i fem till tio sekunder, rotera sedan sprutan 180 grader, så att avfasningen är vänd nedåt för att skapa en tätning, och för att förhindra vaccinläckage, innan du långsamt drar tillbaka nålen från injektionsstället.
Sedan tillbaka musen till sin bur, med övervakning, tills full återhämtning. Ungefär två veckor efter att ha ökat, infekterar immuniserade möss. Ta tag i en sövd mus genom scruff av ryggkorgen bröstkorg, bakom skulderbladen och halsen, och placera musen upprätt för att komma åt näsan.
Med hjälp av en 200 mikroliterpipetsspets, applicera långsamt 20 till 25 mikroliter av bakterieinokulat av intresse för varje nare av djuret, hålla musen tills hela inokulat har inhalerat. Sedan leverera en lika stor volym av steril PBS till en grupp av möss som en negativ kontroll. Vid lämplig experimentell slutpunkt, placera en infekterad mus ventrala sidan upp på en dissekering styrelse, och säkra lemmar.
Blöt kroppen med 70%etanol, och använd forceps för att spänna huden under buken i mitten av bäckenet. Med hjälp av vass sax, gör en vertikal skära upp till underdibel, och dissekera huden från peritoneal väggen. Flytta huden till sidorna av slaktkroppen för att skapa ett obehindtt fält för steril orgelskörd, och förstå den intakta bukhinnan under bröstkorgen, vid eller nära levern.
Skär bukhinnan mot bröstkorgen för att exponera nedre matsmältningskanalen, och flytta tjocktarmen till vänster för att avslöja mjälten. Med hjälp av böjda tövövingar, ta tag i mjälten och dissekera bort bindväven med sax. Placera sedan mjälten i ett koniskt rör på 15 milliliter som innehåller 3 milliliter RPMI, och 5%fetalt bovint serum på is.
Använd tåtäkten för att stabilisera bröstkorgen vid xyphoidprocessen, och skär upp membranet. Lungorna ska tömma, och falla mot ryggraden. Skär upp bröstkorgen vid sidorna för att ta bort bröstplåten, och skär lungartärerna och venerna för att isolera och ta bort den överlägsna loben av höger lunga.
Fixera lob i en 15 milliliter konisk slang på 10%neutral buffrad formalin vid rumstemperatur i minst 24 timmar, och isolera de återstående loberna i höger och vänster lungor. Placera sedan lober i ett koniskt rör på 15 milliliter, innehållande två milliliter 1%-ralin i PBS på is. Använd en en milliliter pipetman med spets för att samla blodet fyller brösthålan, och överföra blodet till en förmärkad 1,5 milliliter microcentrifugrör på is.
Ta bort parotid, sublinguala, och submaxillary körtlar och lymfkörtlar som täcker luftstrupen, och öppna och ta bort de skyddande membran som omger luftstrupen. Med hjälp av fina tlyktor och saxar, försiktigt separera luftstrupen från matstrupen, och alla andra bindväv från toppen av nyckelbenen till botten av underhalan. Använd tärningar för att hålla luftstrupen, och skär luftstrupen på toppen av nyckelbenet.
Dra ner luftstrupen för att maximera elasticiteten, och skär luftstrupen längst ner i underhalkan, precis ovanför struphuvudet, isolera ungefär en centimeter vävnad. Placera sedan orgeln i ett förmärkad 1,5 milliliter mikrocentrifugrör, innehållande 0,3 milliliter 1%-ralin i PBS på is. Vrid nu musen för tydlig tillgång till näsan, och spraya huvudet med 70%etanol.
Manuellt greppa djuret direkt bakom skallen, och använda sax för att skära bort den mjuka köttet av nosen, med början från botten av näsan och rör sig uppåt. Ta bort päls, hud och morrhår från runt näsan, och sätt in tips av en böjd sax i nares med kurvorna pekade nedåt. Skär upp näspassagen mot ögonen, vilket skapar en V-liknande formation.
Använd sedan fina tövråkar för att samla nässkiljeväggen, och mjukvävnad inom formationen, och placera vävnaden i en förmärkad 1,5 milliliter mikrocentrifugrör som innehåller 0,3 milliliter av 1%casein i PBS, på is. För att bearbeta lungvävnaden, överför hela lungprovet röret innehållet i en steril 15 milliliter Dounce homogenisator, och använda en mortelstöt för att homogenisera vävnaden. Dissociate provet tills inga stora partiklar av vävnad kvar, och återföra den homogeniserade suspensionen till den ursprungliga 15 milliliter röret.
Ta bort en 0,3 milliliter alikvot för plätering av koloniformningsenheter, och samla resten av homogenatet genom centrifugeringen. Aliquot 0,5 milliliter supernatant i förmärkta mikrocentrifugrör för lagring vid 20 grader Celsius tills cytokin uttryck analys av Eliza. Späd sedan ut 0,1 milliliter alikvoter av den avsatta homogeniserade lungupphängningen i 0,9 milliliter steril PBS per spädning, och använd en steril triangelspridare till platta 0,1 milliliter av varje empiriskt vald utspädning på förmärkta 10%Bordet-Gengou plus streptomycinplattor.
Här visas representativ optisk densitet 600 mätningar och beräkningar för att uppnå en en optisk densitet bakteriell suspension, för att förbereda en hundrafaldig utspädd bakteriell inokulat som ska levereras till möss. Efter sju dagar av vaccin antigen stimulering, immuniserade mjälte celler från gruppen kombinationsvaccin producera interferon gamma, och IL17, medan betydligt ner reglera IL5, främja en T hjälpare, en T helper 17 polarisering av immunsvaret under en B pertussis infektion. Kolonibildande enhet uppräkning av bakterier som återvunnits från luftvägarna frågor av en B kikhosta infekterad mus kan användas för att bedöma de skyddande effekterna av vaccinet av intresse.
Arbeta så snabbt och så effektivt som möjligt för att undvika vävnadsnekros, och lagra den isolerade vävnaden på is för att bevara de återvunna bakteriernas livskraft. ELISpotflödescytometri och DNA- och RNA-isolering kan utföras för att utvärdera immunceller, analytproduktion, och för att möjliggöra epigenetiska och transkriptomiska analyser. När du arbetar med smittämnen som Bordetella pertussis, är det viktigt att komma ihåg att bära lämplig personlig skyddsutrustning, och arbeta i ett certifierat biosäkerhetsskåp för att förhindra patogenöverföring.
Detta protokoll detaljer CFU uppräkning från luftvägarna, specifikt den nasala svalget. För att ta itu med frågor i vaccinet och infektionssjukdomar fält om inriktning bakteriell kolonisering i näsan.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
