Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Primär cell kultur av renade GABAergic eller Glutamatergic nerv celler etablerad genom Fluorescence-aktive rad cell sortering
Chapters
Summary June 6th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll beskriver en cell sortering baserad metod för rening och kultur av fluorescerande GABAergic eller glutamaterga nerv celler från neocortex och Hippocampus av postnatal möss eller råttor.
Transcript
Detta protokoll beskriver en enkel och reproducerbar metod för rening och culturing specifika typer av primära neuron. Dessa kulturer är lämpliga för elektrofysiologisk, morfologisk och överlevnadsanalys. Kulturer av renade nervceller kan användas för att studera fundamenta i neuronal fysiologi, bildandet av synapser samt hur neuronala nätverk utvecklas.
Medan vi fokuserar på när glutamatergic huvudsakliga celler och GABAergic interneurons, detta förfarande kan lätt modifieras för att studera några neuronala linjer uttrycker fluorescerande proteiner. För att förbereda glasöverdrag, tina först en fem milliliter alikvot på 200 mikrogram per milliliter PLL-lösning. Späd ut denna stamlösning till 20 mikrogram per milliliter genom att tillsätta 45 milliliter rent injektionsgrad vatten.
Filtrera sedan sterilisera lösningen till ett nytt koniskt rör på 50 milliliter och märk detta rör som PLL-sterilt. Därefter placerar du 100 steril runda 12 millimeters glaskåpor i den sterila PLL-lösningen. Agitera röret var femte till 10 minuter i två till tre minuter för att säkerställa jämn beläggning.
Efter 40 minuters PLL-beläggning, ta två bitar av mjukpapper och lägg dem platt i flödesskåpet. Sterilisera papperet med hjälp av 70%etanol sedan platta för att ta bort veck och låt torka. Efter beläggning av glasöverdrag i en timme med PLL, avlägsna överskott PLL-lösning och tillsätt sterilt injektionsgrad vatten.
Agitera försiktigt täcken i två till tre sekunder för att avlägsna överflödig PLL. Upprepa detta sköljsteg ytterligare två gånger. Avlägsna överflödigt vatten och överför sedan täcken till det sterila silkespappret.
När du är torr överför du täcken till en 24 brunnskulturplatta. För att förbereda cellodlingslösningarna mäter du ut 12 milliliter cellodlingsbuffert till ett koniskt rör på 15 milliliter och etikett som BSA. Mät ut fem milliliter cellodlingsbuffert till ett annat 15 milliliterrör och etikett som papain.
Därefter inkubera båda rören i 15 minuter vid 37 grader Celsius. Lägg till 120 milligram BSA till röret märkt BSA. Sedan invertera röret för att hjälpa till att lösa upp lösningen.
Lägg sedan till sju milligram papain till röret märkt papain. Returnera båda rören till vattenbadet i 15 minuter. Filter sterilisera BSA-lösningen till ett färskt koniskt rör.
Dela den sterila BSA-lösningen i tre rör och märk varje rör som BSA-steril och antingen en, två eller tre. Nu filtrera sterilisera papain röret och etikett röret som papain steril. Återför alla rören tillbaka till vattenbadet och fortsätt att inkubera i 37 grader Celsius tills användning.
För att förbereda för vävnad dissekering, lägg ut skalpell, sax, tlyktor och spatel som krävs för dissekering av hippocampus och cortex. Placera två 35 millimeters petriskålar och en 100 millimeter petriskål som innehåller sterilt filterpapper i flödesskåpet. Samla transgena NexCre; Ai9 eller vesikulära GABA transportör Venus mus ungar som skall dissekeras med hjälp av en lysrör med lämplig excitation och utsläpp filter för att diskriminera fluorescerande ungar från vilda typ liter kompisar.
Omedelbart före dissekering av djuren, fyll i varje Petri-skålen med kyld steril cellodlingsbuffert. Efter dissektion, överför noggrant den transgena valpens hjärna till ett sterilt filterpapper. Först dissekera bort lillhjärnan och separera de två halvkloten.
Sedan försiktigt separera hippocampus och cortex från varje halvklot. Överför den dissekerade vävnaden till en 35 millimeter petriskål som innehåller kyld cellodlingsbuffert. Överför sedan dissekerade hippocampus och cortex till locket till en annan 35 millimeter Petri skålen.
Med hjälp av den platta kanten av en skalpell blad, försiktigt hacka vävnaden i en kors och tvärs rörelse tills endast små bitar kvar. Därefter överför den hackade vävnaden med en liten mängd papainlösning från Petri-skållocket till det sterila papainröret. Inkubera vävnaden vid 37 grader Celsius i 25 minuter.
Efter papain inkubation, överför den sterila papain röret och sterila BSA rör till flödesskåpet. Använd sedan en en milliliter Pasteur pipetter för att överföra endast corticohippocampal vävnad från papain röret i BSA röret en. För att bryta upp några stora klumpar av vävnad, triturate vävnaden flera gånger med hjälp av en milliliter Pasteur pipett.
Efter detta, triturate vävnaden sju gånger med hjälp av en fin spets Pasteur pipett. Efter 30 sekunder överför du en milliliter av den nedre lösningen och vävnaden från BSA-röret ett till BSA-röret två. Triturate vävnaden i BSA röret två flera gånger med hjälp av en fin spets Pasteur pipett.
Efter trituration, överför en milliliter av den nedre vävnaden och lösningen från BSA-röret ett till BSA-rör tre. Triturate vävnaden i BSA röret tre flera gånger. Efter trituration, överför all lösning och vävnad från rör två och tre till BSA-röret ett.
Triturate två till tre gånger och centrifug vid 3, 000 gånger g i tre minuter. Efter centrifugeringen, avlägsna försiktigt supernatanten från den pelleterade vävnaden och återanvänd cellerna med hjälp av en P1000-pipett i två milliliter komplett övervintra Ett lågfluorescensmedium. Sedan triturate vävnaden 20 gånger för att säkerställa fullständig resuspension av vävnadslösningen.
Därefter filer cellen suspension genom en 30 mikrometer cell sikt i en polystyren provrör. Förbered cellsorteringsuppsamlingsrör genom pipettering av 300 mikroliter av komplett viloläge A-media till det antal polypropylenrör som krävs. För varje fluorescerande celltyp som ska sorteras väljer du lämpliga excitations- och emissionsfilter.
Excitera Venus protein med hjälp av 488 nanometer excitation våglängd och upptäcka det avgivna ljuset genom 530/40 utsläpp filteruppsättning. Excitera TdTomato protein med hjälp av 531 nanometer excitation våglängd och detektera det avgivna ljuset genom 575/30 utsläppsfilteruppsättning. För hög renhet, sortera ljust märkta fluorescerande celler.
Efter cellsortering överför du de insamlade cellerna till två milliliter runda bottencentrifugrör. Sedan centrifugera cellerna vid 3, 000 gånger g i tre minuter för att bilda en cell pellet. Resuspend cellen pelleten i den erforderliga mängden förvuppvade komplett NBA medium för att uppnå en celltäthet på 1, 000 celler per mikroliter.
För att bekräfta förekomsten av dissocierade celler, kontrollera celllösningen under ett mikroskop med hjälp av en 4X eller en 10X objektiv lins. Innan du plätering cellerna, virvel med en medelhög hastighet i två till tre sekunder för att säkerställa en jämn cell suspension. Efter virvelning, snabbt pipettera 10 mikroliter av cellen suspension till mitten av varje coverslip.
Efter en timme, mata cellerna med 500 mikroliter av förvörd komplett NBA medium och återgå till inkubatorn vid 37 grader Celsius. Att samkultur de renade nervceller och gliaceller, passage gliaceller till erforderligt antal cellodling skär. Detta görs genom att plätering 40, 000 glial celler i en 500 microliter droppe komplett NBA medium.
Efter en timme, överföra gliaceller cellodling skär till renas nervceller. Avlägsna överskottsmedia från odlingsinsatserna och lämna tillbaka plåtarna till inkubatorn för odling. Efter framgångsrik sortering, pläterade nervceller ska visas runda i form med en slät membran och bör ses för att skona upp neuroids efter cirka en timme in vitro.
Genom sju dagar in vitro, även om vissa celldöd kan vara uppenbart, bör livskraftiga celler finnas i alla odlingsförhållanden. Analys av renade kulturer visar att både glutamatergic och GABAergic nervceller kunde förlänga axoner och dendriter från sina cell organ och behålla förmågan att generera åtgärder potentialer som svar på super tröskel depolariserande nuvarande injektioner. Noterbart efter rening, endast GABAergic nervceller fick betydande mängd spontana synaptisk överföring och glutamatergic nervceller fick mycket lite synaptisk överföring i avsaknad av gliaceller.
Viktigt, culturing renade nervceller med gliaceller förbättrar neuron tillväxt och överlevnad samt främja synaptisk överföring i glutamatergic kulturer. Tillräcklig polariserande beläggning av täcken och upprätthålla den fysiologiska pH av kulturen media under hela förfarandet är nyckeln till att säkerställa god kvalitet cellkulturer. Efter detta protokoll bör det vara möjligt att utföra RNA-sekvensering och protein masspektroskopi på renade kulturer som gör det möjligt att undersöka translationella och transkriptionella processer i specifika neuronala typer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
