Login processing...

JoVE Journal
Bioengineering

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Bioengineering

Opptak av nye Lipid-belagt nanopartikler som inneholder Falcarindiol av menneskelige stamceller

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Journal (Bioengineering)

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Journal (Bioengineering)

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Click here for the English version

Opptak av nye Lipid-belagt nanopartikler som inneholder Falcarindiol av menneskelige stamceller

Article DOI: 10.3791/59094-v

February 9th, 2019 •

Emma Pipó-Ollé¹, Prasad Walke², Martine K. Notabi¹, Rime B. El-Houri¹, Morten Østergaard Andersen¹, David Needham^2,3,4, Eva C. Arnspang¹

¹Department of Chemical Engineering, Biotechnology and Environmental Technology, University of Southern Denmark, ²Center for Single Particle Science and Engineering (SPSE), Institute for Molecular Medicine, Health Sciences, University of Southern Denmark, ³Department of Mechanical Engineering and Material Science, Duke University, ⁴School of Pharmacy, University of Nottingham

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 9th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne artikkelen beskriver innkapsling av falcarindiol i lipid-belagt 74 nm nanopartikler. Mobilnettet opptaket av nanopartikler av menneskelige stamceller i lipid dråper overvåkes av fluorescerende og AC confocal bildebehandling. Nanopartikler fremstille av rask injeksjon metoden løsemiddel skiftende, og deres størrelse måles med dynamisk lysspredning teknikken.

Transcript

Fabrikasjonen av lipidbelagte nanopartikler med den raske injeksjonsmetoden gir et stabilt legemiddelleveringssystem for kreftbehandling. Denne teknikken er en enkel, rask, skalerbar og reproduserbar teknikk for nanopartikkelfabrikasjon som omslutter hydrofobe legemidler. Denne teknikken gjelder for å fremstille diagnostiske og terapeutiske nanopartikler fra bindestrekobe materialer som effektivt kan brukes under flere sykdomsforhold.

Denne fabrikasjonsteknikken, sammen med DLS, kan brukes til å studere kjernering og vekst av hydrofobe materialer, som lipider, proteiner og polymerer. Å vite de fysiske kjemiske egenskapene til stoffet ditt er avgjørende før det fabrikkerer nanopartiklene. Pass også på å bruke de riktige konsentrasjonene av belegglipider.

Visuell demonstrasjon av denne metoden er avgjørende for å vise enkelheten i fabrikasjonsteknikken og for å vise vellykket levering av stoffet som nanopartikler til cellene. Forholdsregler må tas når du arbeider med kloroform og formaldehyd, og arbeid under en røykhette er nødvendig. Til å begynne med dispenserer du 2,4 milliliter med 250 mikromolar falkarindiol lagerløsning oppløst i 70% etanol i et scintillasjons hetteglass.

Bruk en prøvekonsentrator til å fordampe væskefraksjonen i omtrent fire timer for å oppnå tørr falkarindiol. Bruk prøvekonsentratoren til å levere gass over prøven ved romtemperatur for å konsentrere prøven. Når de er tørket, tilsett komponentene som er vist her til hetteglasset med scintillasjon i en røykhette, og sørg for å rengjøre sprøyten med kloroform etter å ha lagt til hver komponent for å unngå krysskontaminering.

Lukk deretter hetteglassene som inneholder lipidene umiddelbart, slik at oppløsningsvæsken ikke fordamper og dermed endrer konsentrasjonen. Pakk hetteglasset med aluminiumsfolie for å beskytte DiI mot lys og la prøven over natten i desiccatoren fordampe kloroformen. Neste dag oppløs den uttørkede prøven i absolutt etanol for å lage et endelig volum på 1,2 milliliter.

Denne løsningen representerer den organiske fasen. Ta et 12 milliliter hetteglass og fyll det med ni milliliter renset vann. Tilsett deretter en magnetisk loppe i hetteglasset som inneholder ni milliliter vann.

Plasser hetteglasset på en magnetisk rører og rør ved 500 o/min. Fest deretter en en milliliter glasssprøyte til dispenseringssystemet og trekk sakte kloroformen inn og ut av glasssprøyten minst 10 ganger. Dispenser kloroformen i avfallsoppsamleren hver gang.

Rengjøring av sprøyten med kloroform bidrar til å unngå kontaminering. Nå prime sprøyten med etanol. Priming erstatter det gamle løsningsmidlet samt fjerner eventuelle luftbobler.

Bruk sprøyten, aspirer en milliliter av den organiske fasen, og sett sprøyten inn i hetteglasset opp til midten av det ni milliliter vannmerket. Hold den stødig midt i hetteglasset, og injiser oppløsningen med 833 mikroliter per sekund ved å trykke på dispenseringsknappen på dispenseringssystemet. Dette genererer 10 mikroliter med 50 mikromolar lipidbelagte nanopartikler av falkarindiol i 10% etanol.

Denne injeksjonshastigheten har blitt funnet for å oppnå fineste nanopartikler med smal partikkelstørrelsesfordeling. Under injeksjon er det viktig å sørge for at nålen settes inn i midten, stødig og rett. Umiddelbart etter injeksjonen, fjern hetteglasset fra røreren og overfør prøven til en 50 milliliter rund bunnkolbe.

Angripe kolben til den roterende fordamperen, og fordampe en milliliter av det organiske løsningsmidlet ved romtemperatur. Vær forsiktig med å unngå overflødig bobledannelse. Overfør nanopartikkelfjæringen fra kolben til et annet 12 ml hetteglass med glass.

Kontroller at volumet er ni milliliter, og del deretter prøven i to 12 milliliter hetteglass. Tilsett deretter 0,5 milliliter ultra rent vann i et av hetteglassene og 0,5 milliliter 10X fosfatbufret saltvann i det andre hetteglasset. Slå på det digitale lyssprederende instrumentet, og sett ønsket temperatur til 20 grader Celsius til det stabiliserer seg.

Still deretter inn instrumentparametrene som vist her. Fyll plastcuvette med en milliliter nanopartikkelfjæring, og start målingen. Rapporter den målte størrelsen avhengig av løsningsmidlet som ble brukt.

Seed ca 50, 000 celler på sterile 1,5 cover slips plassert i seks-brønns plate for å oppnå en celle tetthet på ca 30%Deretter legge kultur medium for å ha et endelig volum på tre milliliter i hver brønn. Inkuber cellene i 24 timer under standard kulturforhold. Neste dag, legg til tre mikroliter av nanopartikkelløsningen for en endelig falkarindiolkonsentrasjon på fem mikromos.

Deretter returnerer cellene til inkubatoren i 24 timer. Etter 24 timers behandling, vask cellene to ganger med PBS, og fest dem deretter i 4% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Etter fiksering gjennomsyrer cellene med 0,1% Triton X-100 i 30 minutter.

Vask dem deretter to ganger med PBS, og beis dem med 250 mikroliter på 300 nanomolar DAPI i fem minutter, beskyttet mot lys. Plasser dekselet på et lysbilde ved hjelp av en dråpe PBS. Slå til en 150x subjektiv, og overføre lysbildet til scenen av et bredt felt fluorescens mikroskop utstyrt med et elektron multiplisert CCD-kamera.

Bildeceller ved hjelp av GFP-LP-kanalen. I tillegg må du kontrollere opptaket av nanopartiklene i cellene ved å ta konfokale mikroskopibilder ved hjelp av et 63x oljemål med en numerisk blenderåpning på 1,4. Bilde DiI ved hjelp av en argon laser på 514 nanometer og DAPI ved hjelp av en to-foton laser på 780 nanometer.

Ubestrøkede nanopartikler av falkarindiol dannet i vann og målt i PBS viste høy polydisperitet, med PD-indeks på 0,571. Denne verdien indikerer bred og ikke-ensform fordeling av partikkelstørrelser. Lipidbelagte nanopartikler av falkarindiol fabrikkert i denne videoen var derimot på 74,1 nanometer med en polydisperitetsindeks på 0,182, indikerte en relativt monodisperse og ensartet fordeling av partikkelstørrelser.

Som en første observasjon av nanopartikler inne i cellene ble epifluorescence mikroskopibilder kjøpt etter 24 timers behandling. Nanopartiklene ble visualisert som hvite, lyse prikker, og det kan hypoteses at nanopartikler var plassert inne i cellene rundt kjernen. For å bekrefte at falkarindiol nanopartikler hadde kommet inn i cellene, ble konfokal mikroskopi utført på cellene også.

Et stort antall nanopartikler er vist her, spredt i cytoplasma i hver celle. Disse resultatene viser at nanopartikler fungerer som et stabilt legemiddelleveringssystem for falkarindiol. Mens du prøver denne prosedyren, Det er viktig å injisere løsningen på riktig injeksjon hastighet, holde seeding stødig, i midten, for å sikre riktig blanding.

Denne prosedyren kan brukes til ethvert hydrofobe legemiddel for å formulere terapeutiske nanopartikler eller for avbildningsmidler for å formulere diagnostiske nanopartikler som kan brukes i ulike sykdomsforhold, for eksempel kreft. Denne teknikken gjorde det mulig å forske mer på mekanismen som nanopartiklene blir tatt opp av celler, samt dets levende celleavbildning og på å studere krefteffekten av stoffet.

X

Simple Hit Counter