Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
人骨髓间充质干细胞吸收含有法卡林多醇的新型脂质包覆纳米颗粒
Chapters
Summary February 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
本文介绍了在脂肪包覆74纳米纳米粒子中的黄他醇的封装。通过荧光和共聚焦成像技术监测人干细胞对纳米颗粒的吸收。采用溶剂移位快速注射法制备纳米粒子, 并采用动态光散射技术对其尺寸进行了测量。
Transcript
利用快速注射法制造脂质涂层纳米粒子，为癌症治疗提供了稳定的药物输送系统。该技术是一种简单、快速、可扩展且可重复的纳米粒子制造技术，用于封装疏水药物。该技术适用于利用疏水性材料制造诊断和治疗纳米粒子，这些纳米粒子可有效用于多种疾病条件。
这种制造技术与DLS一起可用于研究疏水性材料（如脂质、蛋白质和聚合物）的成核和生长。在制造纳米粒子之前，了解药物物质的物理化学性质至关重要。此外，请务必使用正确的涂层脂质浓度。
该方法的视觉演示对于展示制造技术的简单性以及将药物作为纳米粒子成功交付到细胞中至关重要。使用氯仿和甲醛时，需要采取预防措施，并且需要在烟罩下工作。首先，分配2.4毫升的250微摩尔法尔卡林二醇库存溶液溶解在70%乙醇中闪烁的小瓶。
使用样品浓缩器，蒸发液体馏分约四个小时，以获得干燥的法尔卡丁二醇。使用样品浓缩器，在室温下将气体送过样品以浓缩样品。干燥后，将此处显示的组件添加到烟罩中的闪烁小瓶中，在添加每个组件后，确保用氯仿清洁注射器，以避免交叉污染。
然后立即关闭含有脂质的小瓶，使溶剂不会蒸发，从而改变浓度。用铝箔包裹小瓶，保护DiI免受光线的束，将样品留在干燥器中过夜以蒸发氯仿。第二天，将干燥样品溶解在绝对乙醇中，使最终体积为1.2毫升。
此解决方案表示有机相。拿一个12毫升的玻璃瓶，并填充9毫升纯净水。然后加入一个磁性跳蚤到含有9毫升水的小瓶。
将小瓶放在磁力搅拌器上，以 500 rpm 转速搅拌。接下来，将一毫升玻璃注射器连接到点胶系统，并缓慢地将氯仿拉出玻璃注射器至少 10 次。每次将氯仿放入废物收集器中。
用氯仿清洁注射器有助于避免任何污染。现在用乙醇填充注射器。注水取代旧溶剂，并去除任何气泡。
使用注射器，吸气一毫升的有机相，并将注射器插入玻璃瓶，一直插入九毫升水线中间。在小瓶中间保持稳定，通过按下点胶系统上的点胶按钮，以 833 微升/秒的速度注入溶液。这产生10微升50微摩尔脂涂层纳米粒子的法尔卡丁二醇在10%乙醇。
这种喷射速度已发现，实现最好的纳米粒子与狭窄的颗粒大小分布。注射时，重要的是要确保针头插入中心，稳定和直。注射后立即从搅拌器中取出小瓶，将样品转移到50毫升圆形底部烧瓶中。
将烧瓶攻击到旋转蒸发器上，并在室温下蒸发一毫升有机溶剂。谨慎避免过度形成泡沫。将纳米颗粒悬浮液从烧瓶转移到另一个 12 毫升玻璃瓶中。
确保体积为 9 毫升，然后将样品分成两个 12 毫升玻璃瓶。然后在其中一个小瓶中加入0.5毫升的超纯水，将0.5毫升的10X磷酸盐缓冲盐水加入另一个小瓶中。打开数字光散射仪器，将所需温度设置为 20 摄氏度，直到稳定。
然后设置仪器参数，如下所示。用一毫升纳米粒子悬浮液填充塑料盒，然后开始测量。根据使用的溶剂报告测量尺寸。
将约5万个细胞播种在无菌1.5盖滑板上，以获得约30%的细胞密度，然后加入培养，以便每口井中最终体积为3毫升。在标准培养条件下孵育细胞24小时。第二天，加入三微升的纳米颗粒溶液，最终的法卡丁二醇浓度为5微摩尔。
然后将细胞返回孵化器24小时。经过24小时的治疗，用PBS清洗细胞两次，然后在室温下用4%甲醛固定10分钟。固定后，用0.1%Triton X-100渗透细胞30分钟。
然后用 PBS 洗两次，用 250 微升 300 纳米摩尔 DAPI 染色 5 分钟，防止光线。使用 PBS 滴将盖滑到幻灯片上。转向 150 倍主观，然后将幻灯片转移到配备电子倍增 CCD 摄像机的宽场荧光显微镜的舞台上。
使用 GFP-LP 通道的图像单元。此外，使用数值孔径为 1.4 的 63 倍油目标，通过合成显微镜图像验证纳米粒子进入细胞的吸收。在 514 纳米时使用 argon 激光，使用 780 纳米的双光子激光进行图像 DII。
在水中形成并在PBS中测量的未涂层的法卡丁二醇纳米颗粒显示多分散度高，PD指数为0.571。此值表示颗粒大小的广泛和非一匀分布。相比之下，本视频中制造的法卡丁二醇脂质涂层纳米颗粒为74.1纳米，多散度指数为0.182，表明颗粒大小相对单色且分布均匀。
作为对细胞内纳米粒子的第一次观察，经过24小时的治疗，获得了荧光显微镜图像。纳米粒子被想象成白色、明亮的圆点，可以假设纳米粒子位于细胞核周围的细胞内。为了验证法尔卡丁二醇纳米粒子是否进入细胞，在细胞上也进行了共体显微镜。
这里显示大量的纳米粒子，分散在每个细胞的细胞质中。这些结果表明，纳米粒子是法尔卡丁二醇稳定的药物输送系统。在尝试此过程时，重要的是以正确的喷射速度注射溶液，保持播种稳定，在中心，以确保正确的混合。
该程序可用于任何疏水药物，以制定治疗性纳米粒子或成像剂，以制定诊断性纳米粒子，可用于各种疾病条件，如癌症。这项技术使得对纳米粒子被细胞利用的机制、活细胞成像和研究药物的抗癌作用进行了更多的研究。
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
