Journal
/
/
Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes
JoVE Journal
Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Bioengineering
Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes

7,845 Views

10:16 min

March 19, 2019

DOI:

10:16 min
March 19, 2019

15 Views
, , , , , ,

Transcript

Automatically generated

Onder de verschillende strategieën voor de productie van recombinant eiwit in planten, de gedeconstrueerde plantaardige VERS expressie biedt superieure prestaties, wat leidt tot hoge opbrengsten over een relatief kort tijdsbestek. Replicatie van deze technologie voor de productie van een oraal vaccin heeft een groot potentieel om in de nabije toekomst een alternatief te worden voor conventionele vaccins. Lyophilized rode bieten bladeren tijdelijk getransformeerd accumuleert een hoeveelheid foto antigenen geschikt voor orale tolerantie inductie in type een diabetes preventie.

Dit experimentele protocol kan worden uitgebreid tot veel verschillende eetbare soorten na een beoordeling van recombinant eiwitaccumulatie per geval. Het demonstreren van de procedure zal Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo, en Roberta Zampieri. Om met deze procedure te beginnen, kweek je rode bieten- en spinazieplanten in een groeikamer zoals beschreven in het tekstprotocol.

Bevrucht de planten na zaadkieming twee keer per week met een oplossing van commercieel verkrijgbare meststof met een concentratie van één gram per liter. Voor agro-infiltratie, gebruik maken van vijf weken oude spinazie en zes weken oude rode bieten planten. Na de bouw van de plantenexpressievectoren inent u de drie Transformatoren van A.tumefaciens in 50 milliliter LB-medium met rifampicine bij een concentratie van 50 microgram per milliliter en vectorspecifieke antibiotica zoals beschreven in het tekstprotocol.

Groeien door schudden ‘s nachts op 28 graden Celsius. De volgende dag, pellet de bacteriële culturen door centrifugeren op 4500 keer G gedurende 20 minuten. Resuspend de pellet in 100 milliliter infiltratie buffer met 10 millimolar MES en 10 millimolar magnesiumsulfaat.

De suspensies drie uur lang op kamertemperatuur uitbroeden. Meng een gelijk volume van een bacteriële suspensie met een van de hier getoonde modules, met de vijf prime module en de integrase module. Met behulp van een spuit zonder naald, neem vijf milliliter van de schorsing mix.

Druk de punt van de spuit tegen de onderkant van het plantenblad terwijl u de druk zachtjes tegenzet aan de andere kant van het blad. Infiltreren in de eerste drie volledig uitgebreide bladeren, vanaf de top, voor elke plant. Label de agroinfiltrated bladeren met het papieren label op de bladstengel.

Breng de planten vervolgens onder standaardomstandigheden terug naar de groeikamer. Op dag vier tot 14 na infectie, verzamel de agro-geïnfiltreerd bladeren en bevries ze in vloeibare stikstof. Bewaar dit plantenweefsel op min 80 graden Celsius.

Ten eerste, afzonderlijk groeien de drie A.tumefaciens transformatoren in 50 milliliter LB medium met rifampicin bij een concentratie van 50 microliter per milliliter, en passende vector-specifieke antibiotica door schudden ‘s nachts op 28 graden Celsius. De volgende dag, pellet de bacteriële culturen door centrifugeren op 4500 keer G gedurende 20 minuten. Resuspend de pellet in 1 liter infiltratie buffer tot een OD600 van 0,35, en incubeer de schorsingen bij kamertemperatuur gedurende drie uur.

Voeg vervolgens 0,01% van het wasmiddel toe aan elke suspensie. Meng een gelijk volume van een bacteriële suspensie met een van de hier getoonde modules met de vijf priemmodule en de integrase module. Steek een zes weken oude rode bietenplant in de houder.

Omkeren van de houder en plaats het op de top van een beker met twee liter van een infiltratie bad om de bladeren onder te dompelen in de infiltratie suspensie. Breng hierna het infiltratiebad met de ondergedompelde installatie naar de infiltratiekamer en sluit het. Zet de vacuümpomp aan en open de vacuüminlaatklep op de infiltratiekamer.

Zodra de druk in de kamer is gedaald tot 90 millibar, moet u het vacuüm gedurende drie minuten behouden. Laat het vacuüm vervolgens 45 seconden los. Wanneer de kamer is teruggekeerd naar atmosferische druk, open de kamer en verwijder de geïnfiltreerde plant uit het bacteriële bad.

Breng de plant terug naar de groeikamer. Oogst op de dag van maximale expressie de geïnfiltreerde bladeren en bevries ze in vloeibare stikstof zoals eerder beschreven. Oogst eerst de vacuüm agroinfiltrated delta 87 GAD65mut die rode bietenbladeren uitdrukt op de expressiepiek en bevries ze in vloeibare stikstof.

Lyophilize de bevroren bladeren op min 50 graden Celsius en op 0,04 millibar gedurende 72 uur. Bewaar ze dan bij min 80 graden Celsius. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, maal de bladeren tot een fijn poeder en bewaar bij kamertemperatuur in een verzegelde container met silicagel om het vocht uit te sluiten.

Voor de maagvertering simulatie, wegen 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bieten bladeren, en resuspend het in zes milliliter PBS. Gebruik zes molaire zoutzuur om het monster pH aan te passen aan twee. Voeg vier milligram per milliliter pepsine van varkens maagslijmvlies, en 10 millimolar zoutzuur, om een definitieve pepsine concentratie van een milligram per milliliter te verkrijgen.

Schud het monster op 37 graden Celsius gedurende 120 minuten. Gebruik vervolgens natriumhydroxide om de pH van het monster aan te passen tot acht en de pepsine te inactiveren. Breng 750 microliter aliquots van elk monster over naar microcentrifugebuizen en vercentrifugeer de aliquots op 20.000 keer G en gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.

Verzamel elke supernatant afzonderlijk, en resuspend elke pellet in een supernatant volume van de lading buffer. Analyseer vervolgens zowel de supernatant als de geresuspended pellet door Western blot analyse. Voor de celintegriteitsanalyse bereidt u twee monsters van 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bietenbladeren en resuspend beide in zes milliliter PBS.

Gebruik zes molaire zoutzuur om de pH van één monster aan te passen aan twee. Schud beide monsters op 37 graden Celsius gedurende 120 minuten. Dan aliquot 750 microliters van elk monster om microcentrifuge buizen.

Centrifuge op 20.000 keer G en bij 4 graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel elke supernatant afzonderlijk, en resuspend elke pellet in een supernatant volume van de lading buffer. Analyseer vervolgens zowel de supernatant als de geresuspended pellet door Western blot analyse.

Weeg eerst 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bietenbladeren en zet het opnieuw op in acht milliliter steriele PBS. Vortex voor één minuut. Plaat een milliliter van elk gevriesdroogd bladhomogenaat in een van de vijf bereide selectieve LB-media.

Broed de platen drie dagen lang op 28 graden Celsius. Tel hierna de agrobacteriumkolonies die op elke plaat worden geteeld en bereken de resterende bacteriële lading als het aantal kolonievormende eenheden per milliliter van het gevriesdroogde bladhomogenaat. In dit werk wordt een oraal vaccin ontwikkeld in eetbaar plantweefsel.

Rode bieten en spinazieplanten worden handmatig agroinfiltrrated met suspensies van A.tumefaciens die EGFP recombinant expressievectoren dragen, en de fluorescerende eiwitexpressie wordt gevisualiseerd door westerse vlekanalyse en gekwantificeerd onder UV-licht. Het rodebietensysteem wordt gekenmerkt door een hogere EGFP-expressie, die ongeveer 544 microgram per gram vers bladgewicht bereikt na negen dagen na infectie, terwijl de spinazie slechts een maximumniveau van ongeveer 113,4 microgram per gram vers bladgewicht bereikte op 11 dagen na infectie. Hierdoor wordt de rode bieten geselecteerd als expressiehost voor alle volgende experimenten.

Planten worden vervolgens vacuüm geïnfiltreerd met een A.tumefaciens suspensie. Na de TSP-extractie uit agro-infiltratiebladeren worden de monsters geanalyseerd door westerse vlek en wordt het recombinant eiwit relatief gekwantificeerd door een densitometrieanalyse. Ten slotte worden de parameters voor de ontwikkeling van een mogelijk oraal vaccin geëvalueerd.

Zoals hier te zien, wordt het doeleiwit gezien als stabiel na het lyophilisatieproces. Maagvertering wordt gesimuleerd door het varkenszuurenzym pepsine toe te voegen aan gevriesdroogd materiaal, hetzij tot een uiteindelijke concentratie van één milligram per milliliter, of een verhouding van één tot 20, aan TSP. Beide spijsverteringsbehandelingsvoorwaarden resulteren in afbraak van het recombinant eiwit.

De afwezigheid van een specifiek signaal in de pelletmonsters na pepsine spijsvertering suggereren dat na vriesdrogen, de plantencellen hun integriteit verloren, en dit leidde tot de beoogde eiwitafbraak. De procedure moet zorgvuldig worden aangepast aan de plantensoorten met betrekking tot vacuüminfiltratie en het doelrecombinant eiwit met betrekking tot de analyse van de tijdscursus. De demonstrerende procedure kan ook worden gebruikt voor de productie van biofarmaceutische geneesmiddelen die bestemd zijn voor orale levering, zoals vaccin en antilichamen.

Summary

Automatically generated

Hier presenteren we een protocol voor de productie van een kandidaat van de orale vaccin tegen Type 1 diabetes in een eetbare plant.

Read Article