Login processing...

JoVE Journal
Bioengineering

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Bioengineering

Materiale dannelse av rekombinant Spider silke gjennom vandig løsnings ved hjelp av varme og trykk

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Journal (Bioengineering)

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Journal (Bioengineering)

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Click here for the English version

Materiale dannelse av rekombinant Spider silke gjennom vandig løsnings ved hjelp av varme og trykk

Article DOI: 10.3791/59318-v

May 6th, 2019 •

Justin A. Jones¹, Thomas I. Harris¹, Brianne E. Bell¹, Paula F. Oliveira¹

¹Department of Biology, Utah State University

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

May 6th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Her presenterer vi en protokoll for å produsere vannløselige rekombinant Spider silke protein løsninger og materialet skjemaer som kan dannes fra disse løsningene.

Transcript

Denne metoden for solubilisering av rekombinante edderkoppsilke produserer materialformer som ikke er mulige ved hjelp av tradisjonelle harde organiske løsemidler. Videre er prosessen korn, noe som resulterer i en enkel proteinløsning i vann. Ved å bruke denne metoden opprettholder eller produsert materiale de ønskelige egenskapene til edderkoppsilkeproteiner.

Denne solubiliseringsteknikken for rekombinant edderkoppsilke gir mulighet for solubilisering av rekombinant edderkoppsilke i en ett-trinns prosess. Dette er ønskelig fordi disse notorisk vanskelig å produsere proteiner ikke går tapt gjennom omfattende behandling. Videre, siden løsningene bare er protein i vann, kan andre biologisk aktive forbindelser legges til hvis det er ønskelig for applikasjonen.

Spesielt proteinstrukturfunksjonsforholdet, dette systemet er memetisk til hvordan en edderkopp lager en fiber ved at den bruker vann og proteiner ved høy konsentrasjon. Ved å bruke denne solubiliseringsmetoden og en etterfølgende materialdannelse, bør det være mulig å få forståelse i materialene som dannes, og strukturene som er ansvarlige for dem. Det antas at det kan være, vi har brukt denne teknikken for solubilizing syntetiske peptider som ellers ville kreve et alkalisk eller surt miljø for å solvate.

Det kan være en fordel i nedstrøms programmer for disse peptider. Videre har en rekke kjente proteiner når uttrykt syntetisk en tendens til å ende opp i den uoppløselige fraksjonen. Resolubilizing, og deretter refolding disse proteinene er ofte en arbeidskrevende prosess som resulterer i store tap.

Ved å bruke denne teknikken, Det kan være mulig å øke effektiviteten av utvinning prosesser for uoppløselige proteiner. Å plassere et forseglet hetteglass i en mikrobølgeovn er litt skremmende å gi risikoen for overoppheting og dermed overtrykke hetteglasset. Det er avgjørende å forstå den iscenesatte tilnærmingen til å bruke varme og trykk.

For det andre, for rekombinant edderkoppsilke spesielt, vil det å ha salt tilstede ikke tillate teknikken å fungere eller fungere så effektivt avhengig av hvor mye salt som er tilstede. Fjerning av salt er nøkkelen. Vær tålmodig og forsiktig, nøye overvåke mikrobølgeovn ganger og temperaturer inne i hetteglasset.

Det er avgjørende fordi det er en rekke bevegelige deler til drift som ofte er vanskelig å formidle gjennom tradisjonelle skriftlige materialer og metodeseksjoner. Gitt at det er mange proteiner som har løselighetsproblemer som forhindrer tilstrekkelig studie, har denne metoden potensial til å bli brukt på tvers av en rekke proteinrom for å forbedre, eller til og med tillate analytiske teknikker og karakterisering. Til å begynne med velger du et rent og nytt åtte milliliter autoklaverbart borosilikatglasskulturglass med en gummiforet skrukorkhette, og plasserer det tomme hetteglasset på en analytisk balanse.

Riv massen av det tomme hetteglasset slik at balansen leser null masse. Tilsett ønsket lyofilisert rekombinant edderkoppsilkeproteinpulver til det tomme hetteglasset for det spesifikke materialet. Deretter legger du til ønsket mengde ultra rent vann, minst to milliliter, til hetteglasset.

Forsegle hetteglasshetten, og virvle innholdet raskt for å skape en dispergert og homogen rekombinant edderkoppsilkeproteinblanding. Utfør en siste kontroll av hetteglasshetten for å sikre at den er godt og godt strammet. Deretter overfører du den suspenderte rekombinante edderkoppsilkeproteinblandingen til en konvensjonell mikrobølgeovn med effektområdet på 700 til 1500 watt.

Begynn driften av mikrobølgeovnen med fem sekunders serier satt full effekt ved å slå den av og på manuelt. Etter hvert utbrudd, kort åpne døren, og bland hetteglasset forsiktig for å forhindre bosetting, og vedlikehold den suspenderte blandingen. Av og til la hetteglasset og oppløsningen avkjøles, og forhindre at den overopphetede oppløsningen berører forseglingen.

Bruk et infrarødt termometer for å måle temperaturen på oppløsningen som inneholder deler av hetteglasset. Gjenta mikrobølgeovnprosessen til temperaturen når minst 130 grader Celsius, og alle de faste partiklene er fullstendig oppløst. Deretter lar temperaturen på oppløsningen og hetteglasshetten avkjøles under 100 grader Celsius.

Før denne oppløsningen er helt avkjølt, kast det fra hetteglasset til spesifikke geometrier for å danne en hydrogel. Etter at hydrogelen er dannet, legg den i et vannbad, og overfør den til fryseren ved minus 20 grader Celsius. Vent til badet er frosset helt.

Fullfør svampdannelsesprosessen ved å fjerne den frosne hydrogelen og vannbadet fra fryseren, og tin ved 25 grader Celsius. Fjern deretter den resulterende svampen fra det tinte vannet. For å forberede en lyogel, overfør en frossen hydrogelprøve til en lyofilisator.

Etter 24 timer, fjern det endelige lyofiliserte gelmaterialet fra fartøyet. For å produsere filmer av rekombinant edderkoppsilkeprotein, kast 200 mikroliter av det varme solubiliserte rekombinante edderkoppsilkeproteinet fra hetteglasset til en PDMS-form av ønsket form. Etter at det er tørket, fjern det av PDMS-substratet for testing eller behandling.

For å forberede et belegg som ikke kan fjernes fra substratet, bruk en airbrush-sprøyter til å påføre det solubiliserte rekombinante edderkoppsilkeproteinet for å utføre et innledende spraybelegg på det du må bruke. Etter at det er tørket, senk det belagte substratet ned i det solubiliserte rekombinante edderkoppsilkeproteinet for å danne et dip belegg. Gjenta dip belegget for å oppnå ønsket tykkelse.

For å danne lim, bruk en pipette til å legge til det solubiliserte rekombinante edderkoppsilkeproteinet på et substrat, og bruk deretter et andre substrat over toppen av løsningen. Klem bitene godt sammen, og tørk deretter prøvene i en ovn med en minimal temperatur på 25 grader Celsius i minst 16 timer. For å generere våte spunnet fibre, bruk en 19 gauge glide nål, og last den solubiliserte dopløsningen i en konsentrisk sprøyte med en Luer låsespiss.

Løs ut luftbobler, og la dop sitte på Luer-låsenden av sprøyten. Sett inn minst 25 millimeter PEEK-rør i PEEK-slangens fingertette beslag i ett stykke for en over 16 tommers ytre diameter og 10 over 32 kam. Sett på plass 19 gauge-nålen med dette oppsettet på Luer lock female adapter på sprøyten.

Deretter plasserer nitrilhansker på utsiden av de mellomliggende godets, for å holde fiberen som skal genereres fra å skli, og for å unngå å skade motorene. Få et høyt klart glassbad med 99% ren isopropanol å bruke som koagulasjonsbad. Fyll det første strekkbadet med et 80 til 20-forhold mellom isopropanol og destillert vann.

I den andre strekningen bad, fyll en 20 til 80 forholdet mellom isopropanol og destillert vann. Sett opp godet stretch-systemet på datamaskinen. For å justere hovedhastigheten på fiberfjerning, juster glidestangen for godet trilling En hastighet til en verdi mellom 10 og 14 millimeter per sekund, avhengig av hvor godt og raskt fiberen dannes.

Start en første strekk ved å flytte glidestangen i den godet trippel B stretch ratio til to For den endelige godet i strekningen bad en, Den midterste øvre godet, og den første godet i strekk bad to. Start den andre strekningen ved å flytte glidestangen i den godet trippel C stretch ratio til to for den endelige godet i strekk bad to, den siste øvre godet, og winder. Dette oppsettet sikrer at den første godet etter koagulasjonsbadet, og den første godet i den første strekningen bad roterer i samme hastighet.

Deretter legger du silkeoppløsningen i sprøyten til et tilpasset spin lineinstrument. I det automatiserte systemet, sett ekstruderingshastigheten til 10 millimeter per sekund, for å ekstrudere silkeløsningen i glasskoagulasjonsbadet fylt med isopropanol. La fiberprofilen bli ensartet, før du trekker fibrene ut av badet med en tynn metallkrok.

Kontroller at fjerning av fiberen fra badet skaper en løkke mellom PEEK-rørspissen og fiberens bane som forlater badet. Guide den hentet fiber gjennom serien av godets, slik at fiberen er nedsenket i strekningen bad, men tørking i luften mellom strekningen bad, og før du går på en spole. I denne protokollen gjennom en solubilisering av rekombinant edderkoppsilkeprotein, kan en rekke materielle former oppnås.

Syv materialformer presenteres her. Hydrogeler, lyogler, svamp, lim, belegg, filmer og fibre. Fibre krever den mest omfattende behandlingen ved å ekstrudere inn i et koagulasjonsbad, og deretter serielt strekke rå fiber i post bin strekk bad.

Gitt at protein- og vannløsningene varmes opp til en relativt høy temperatur og trykk, har vår erfaring vært at løsningene er sterile på det punktet proteinet er solvated. Dette gjør at noen av de materielle formene som presenteres her, kan tas til cellekultur, så lenge de håndteres riktig, for å studere cellulær respons på materialene. Gjerne denne teknikken har ført til oppdagelsen av nye materialformer, inkludert lim og svamp materiale.

Materialformer som ikke nødvendigvis er orientert mot fiberdannelse, selv om fiberdannelse er et av områdene som også har sett forbedring gjennom utviklingen av denne teknikken. Generering av varme og trykk inne i et forseglet hetteglass har iboende fare. Bruk alltid personlig verneutstyr når du utfører disse prosedyrene.

X

Simple Hit Counter