היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ

שיטה זו של מינון משי עכביש רקומביננטי מייצרת צורות חומר שאינן אפשריות באמצעות ממיסים אורגניים קשים מסורתיים. יתר על כן, התהליך הוא דגנים, וכתוצאה מכך פתרון חלבון פשוט במים. על ידי שימוש בשיטה זו, החומרים שנוצרו או יוצרו לשמור על המאפיינים הרצויים של חלבוני משי עכביש.

טכניקת מינון זו עבור משי עכביש רקומביננטי מאפשרת מינון של משי עכביש רקומביננטי בתהליך צעד אחד. זה רצוי כי אלה ידוע לשמצה קשה לייצר חלבונים לא הולכים לאיבוד באמצעות עיבוד נרחב. כמו כן, מאז הפתרונות הם רק חלבון במים, תרכובות פעילות ביולוגית אחרות ניתן להוסיף אם זה רצוי עבור היישום.

במיוחד, מערכת היחסים תפקוד מבנה החלבון, מערכת זו היא memetic איך עכביש עושה סיבים גם כי הוא מנצל מים וחלבונים בריכוז גבוה. על ידי שימוש בשיטת מינון זו ובהיווצרות חומרים עוקבת, יש להבין את החומרים שנוצרו ואת המבנים האחראים עליהם. הוא חשב שזה יכול להיות, השתמשנו בטכניקה זו עבור מתבודד פפטידים סינתטיים שאחרת ידרוש סביבה בסיסית או חומצית לפתיר.

זה יכול להיות יתרון ביישומים במורד הזרם עבור פפטידים אלה. יתר על כן, מספר חלבונים ידועים כאשר בא לידי ביטוי לאכסון נוטים בסופו של דבר בשבר מסיס. Resolubilizing, ולאחר מכן refolding חלבונים אלה הוא לעתים קרובות תהליך מייגע שתוביל להפסדים גדולים.

על ידי שימוש בטכניקה זו, ייתכן שניתן יהיה להגביר את היעילות של תהליכי התאוששות עבור חלבונים מסיסים. הצבת בקבוקון אטום במיקרוגל היא קצת מרתיעה נותן את הסיכון של התחממות יתר ובכך מעל לחץ על הבקבוקון. הבנת הגישה המבוימת להחלת חום ולחץ היא קריטית.

שנית, עבור משי עכביש רקומביננטי בפרט, לאחר מלח נוכח לא יאפשר את הטכניקה לעבוד או לעבוד ביעילות בהתאם כמה מלח קיים. הסרת מלח היא המפתח. היו סבלניים וזהירים, עקבו מקרוב אחר זמני המיקרוגל והטמפרטורות בתוך הבקבוקון.

זה קריטי כי יש מספר חלקים נעים לפעולה כי הם לעתים קרובות קשה להעביר באמצעות חומרים כתובים מסורתיים וקטעי שיטה. בהתחשב בכך שיש חלבונים רבים שיש להם בעיות מבודדות המונעות מחקר הולם, שיטה זו יש פוטנציאל להיות מיושם על פני מגוון רחב של מרחבי חלבון כדי לשפר, או אפילו לאפשר טכניקות אנליטיות ואפיון. כדי להתחיל, בחר בקבוקון תרבות זכוכית אוטומטית 8 מיליליטר נקי וחדש עם כובע בורג מצופה גומי, והצב את הבקבוקון הריק על איזון אנליטי.

לקרוע את המסה של הבקבוקון הריק כך האיזון קורא אפס מסה. מוסיפים את אבקת חלבון משי עכביש רקומביננטי lyophilized הרצוי לבקבוקון הריק עבור החומר הספציפי. לאחר מכן, מוסיפים את הכמות הרצויה של מים טהורים במיוחד, לפחות שני מיליליטר, לבקבוקון.

לאטום את כובע הבקבוקון, ומערבולת בזריזות את התוכן כדי ליצור תערובת חלבון משי עכביש מפוזר הומוגני. בצע בדיקה סופית של מכסה הבקבוקון כדי לוודא שהוא התהדק בתקיפות ובבטחה. לאחר מכן, להעביר את תערובת חלבון משי עכביש רקומביננטי מושעה למיקרוגל קונבנציונלי עם טווח כוח של 700 עד 1500 וואט.

התחל בהפעלה של המיקרוגל עם חמישה צרורות שניות להגדיר כוח מלא על ידי הפעלה והפעלה ידנית. לאחר כל פרץ, פותחים בקצרה את הדלת ומערבבים בזהירות את הבקבוקון כדי למנוע התיישבות, ושומרים על התערובת התלויה. מדי פעם לאפשר את הבקבוקון ואת הפתרון להתקרר, ולמנוע את הפתרון מחומם יתר על המידה מלגעת החותם.

השתמש מדחום אינפרא אדום כדי למדוד את הטמפרטורה של הפתרון המכיל חלק של הבקבוקון. חזור על תהליך המיקרוגל עד שהטמפרטורה מגיעה לפחות ל -130 מעלות צלזיוס, וכל החלקיקים המוצקים הומסו לחלוטין. לאחר מכן, לאפשר את הטמפרטורה של הפתרון ואת כובע הבקבוקון להתקרר מתחת 100 מעלות צלזיוס.

לפני פתרון זה להיות מקורר לחלוטין, השליך אותו מן הבקבוקון לתוך גיאומטריות ספציפיות כדי ליצור הידרוג’ל. לאחר ההידרוגל נוצר, מניחים אותו באמבט מים, ומעבירים אותו למקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס. חכה עד האמבטיה קפואה לחלוטין.

השלם את תהליך היווצרות הספוג על ידי הסרת הידרוג’ל קפוא ואמבט מים מהמקפיא, והפשרה ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הספוג שנוצר מהמים המופשרים. כדי להכין ליוגל, להעביר דגימת הידרוג’ל קפואה lyophilizer.

לאחר 24 שעות, להסיר את החומר הסופי ג’ל lyophilized מה כלי. כדי להפיק סרטים של חלבון משי עכביש רקומביננטי, יצוק 200 microliters של חלבון משי עכביש רקומביננטי מנוזל חם מן הבקבוקון על צורת PDMS של הצורה הרצויה. לאחר שהוא מיובש, לקלף אותו מצע PDMS לבדיקה או טיפול.

כדי להכין ציפוי שלא ניתן להסיר מהמצע, השתמש מרסס מברשת אוויר כדי להחיל את חלבון משי עכביש רקומביננטי מנוכר לבצע ציפוי ספריי ראשוני על המצע של בחירה. לאחר שהוא מיובש, להטביע את המצע מצופה לתוך חלבון משי עכביש רקומביננטי מנוכר כדי ליצור ציפוי לטבול. חזור על ציפוי המטבל כדי להשיג את העובי הרצוי.

כדי ליצור דבקים, השתמש בפיפטה כדי להוסיף את חלבון משי העכביש המבודד על מצע, ולאחר מכן להחיל מצע שני על החלק העליון של הפתרון. בחוזקה להדק את החלקים יחד, ולאחר מכן לייבש את הדגימות בתנור עם טמפרטורה מינימלית של 25 מעלות צלזיוס לפחות 16 שעות. כדי ליצור סיבים סובבים רטובים, השתמש מחט להחליק 19 מד, טען את פתרון סמים מסיסים לתוך מזרק קונצנטרי עם קצה מנעול לור.

להוציא בועות אוויר, ולתת את הסמים לשבת בקצה מנעול לולר של המזרק. הכנס לפחות 25 מילימטרים של צינורות PEEK לתוך אביזרי אצבע אחת של PEEK עבור קוטר חיצוני אחד מעל 16 אינץ ‘, ו 10 מעל 32 מסרק. החלף את המחט 19 מד עם התקנה זו על המתאם נקבה מנעול לולר של המזרק.

לאחר מכן, מניחים כפפות ניטריל בצד החיצוני של godets ביניים, כדי לשמור על הסיבים להיווצר מחליק, כדי למנוע פגיעה במנועים. קבל אמבטיית זכוכית צלולה גבוהה עם 99% isopropanol טהור להשתמש כאמבט קרישה. ממלאים את אמבטיית המתיחה הראשונה ביחס של 80 עד 20 של isopropanol ומים מזוקקים.

באמבט המתיחה השני, ממלאים יחס של 20 עד 80 של isopropanol ומים מזוקקים. הגדר את מערכת מתיחת godet במחשב. כדי להתאים את המהירות העיקרית של הסרת הסיבים, להתאים את סרגל ההזזה עבור godet שלישייה מהירות A לערך בין 10 ל 14 מילימטרים לשנייה, תלוי כמה טוב ובמהירות הסיב נוצר.

ליזום מתיחה ראשונה על ידי הזזת בר הזזה של godet משולש B למתוח יחס לשניים עבור godet הסופי באמבט למתוח אחד, godet העליון באמצע, ואת godet הראשון באמבט למתוח 2. ליזום את המתיחה השנייה על ידי הזזת בר הזזה של godet משולש C למתוח יחס לשניים עבור godet הסופי באמבט למתוח 2, godet העליון האחרון, ואת הרוח. התקנה זו מבטיחה כי godet הראשון לאחר אמבט קרישה, ואת godet הראשון באמבט מתיחה הראשונה מסתובבים באותה מהירות.

לאחר מכן, לטעון את פתרון המשי במזרק של מכשיר קו ספין מותאם אישית. במערכת האוטומטית, להגדיר את שיעור ההבלטה ל 10 מילימטרים לשנייה, על מנת להחצין את תספורת המשי לתוך אמבט קרישת זכוכית מלא isopropanol. אפשר שבלט סיבים להיות אחיד, לפני משיכת הסיבים מהאמבטיה עם וו מתכת דק.

ודא שהסרת הסיבים מהאמבטיה יוצרת לולאה בין קצה צינורות PEEK לנתיב הסיבים היוצאים מהאמבטיה. מדריך סיבים מאוחזרים דרך הסדרה של godets, כך הסיבים שקועים באמבטיות למתוח, אבל ייבוש באוויר בין אמבטיות למתוח, ולפני הולך על סליל. בפרוטוקול זה באמצעות מינון של חלבון משי עכביש רקומביננטי, ניתן להשיג מגוון צורות חומר.

שבע צורות חומריות מוצגות כאן. הידרוג’לים, ליוגלים, ספוג, דבקים, ציפויים, סרטים וסיבים. סיבים דורשים את העיבוד הנרחב ביותר על ידי הבלטה לאמבט קרישה, ולאחר מכן מתיחה סדרתית של הסיבים הגולמיים באמבטיות מתיחה לאחר סל.

בהתחשב בכך שפתרונות החלבון והמים מחוממים לטמפרטורה ולחץ גבוהים יחסית, הניסיון שלנו היה שהפתרונות סטריליים בנקודה שבה החלבון פתיר. זה מאפשר לכל אחד מהצורות החומריות המוצגות כאן להילקח לתרבות התאים, כל עוד הם מטופלים כראוי, כדי ללמוד את התגובה התאית לחומרים. אין ספק שטכניקה זו הובילה לגילוי צורות חומר חדשות, כולל דבקים וחומר ספוג.

צורות חומר כי הם לא בהכרח אוריינטציה לקראת היווצרות סיבים, אם כי היווצרות סיבים הוא אחד התחומים כי גם ראה שיפור באמצעות הפיתוח של טכניקה זו. יצירת חום ולחץ בתוך בקבוקון אטום יש סכנה אינהרנטית. תמיד ללבוש ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליכים אלה.