Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione
Chapters
Summary May 6th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Qui, presentiamo un protocollo per produrre soluzioni di proteina di seta ragno ricombinante solubile in acqua e le forme di materiale che possono essere formate da queste soluzioni.
Transcript
Questo metodo di solubilizzazione delle sete di ragno ricombinante produce forme di materiale che non sono possibili utilizzando solventi organici duri tradizionali. Inoltre, il processo è grano, risultando in una semplice soluzione proteica in acqua. Utilizzando questo metodo, i materiali formati o prodotti mantengono le caratteristiche desiderabili delle proteine della seta di ragno.
Questa tecnica di solubilizzazione per sete di ragno ricombinante consente la solubilizzazione delle sete di ragno ricombinante in un processo in un'unica fase. Questo è desiderabile perché queste proteine notoriamente difficili da produrre non vengono perse attraverso un'ampia lavorazione. Inoltre, poiché le soluzioni sono solo proteine in acqua, altri composti biologicamente attivi possono essere aggiunti se ciò è auspicabile per l'applicazione.
In particolare, la relazione di funzione della struttura proteica, questo sistema è memetico a come un ragno produce una fibra in quanto utilizza acqua e proteine ad alta concentrazione. Utilizzando questo metodo di solubilizzazione e una successiva formazione del materiale, dovrebbe essere possibile comprendere i materiali che si formano e le strutture che ne sono responsabili. Si pensa che possa essere, abbiamo usato questa tecnica per solubilizzare peptidi sintetici che altrimenti richiederebbero un ambiente alcalino o acido per solvarsi.
Questo può essere vantaggioso nelle applicazioni a valle per quei peptidi. Inoltre, un certo numero di proteine conosciute quando espresse sinteticamente tendono a finire nella frazione insolubile. La risolubilizzazione, e poi il ripienderamento di queste proteine è spesso un processo laborioso che si traduce in grandi perdite.
Utilizzando questa tecnica, potrebbe essere possibile aumentare l'efficienza dei processi di recupero per le proteine insolubili. Posizionare una fiala sigillata in un forno a microonde è un po 'scoraggiante dando il rischio di surriscaldamento e quindi di pressurizzazione del flaconcino. Comprendere l'approccio a fasi per l'applicazione di calore e pressione è fondamentale.
In secondo luogo, per la seta di ragno ricombinante in particolare, avere sale presente non permetterà alla tecnica di funzionare o funzionare in modo così efficace a seconda di quanto sale è presente. La rimozione del sale è la chiave. Sii paziente e attento, monitora attentamente i tempi e le temperature del microonde all'interno del flaconcino.
È fondamentale perché ci sono un certo numero di parti mobili al funzionamento che sono spesso difficili da trasportare attraverso i materiali scritti tradizionali e le sezioni del metodo. Dato che ci sono molte proteine che hanno problemi di solubilità che impediscono uno studio adeguato, questo metodo ha il potenziale per essere applicato attraverso una varietà di spazi proteici per migliorare, o addirittura consentire tecniche analitiche e caratterizzazione. Per iniziare, selezionare una fiala di coltura in vetro borosilicabile autoclavebile da otto millilitri pulita e nuova con un tappo a vite foderato in gomma e posizionare il flaconcino vuoto su un equilibrio analitico.
Strappare la massa della fiala vuota in modo che il saldo legga la massa zero. Aggiungere la polvere di proteina di seta di ragno ricombinante lyophilizzata desiderata alla fiala vuota per il materiale specifico. Quindi, aggiungere la quantità desiderata di acqua ultra pura, almeno due millilitri, al flaconcino.
Sigillare il cappuccio della fiala e vortice vivacemente il contenuto per creare una miscela di proteine di seta di ragno ricombinante disperse e omogenee. Eseguire un controllo finale del cappuccio del flaconcino per assicurarsi che sia stato serrato saldamente e saldamente. Quindi, trasferire la miscela di proteine di seta di ragno ricombinante sospesa in un forno a microonde convenzionale con una gamma di potenza da 700 a 1500 watt.
Inizia il funzionamento del microonde con raffiche di cinque secondi impostate a piena potenza accendendo e spegnendo manualmente. Dopo ogni scoppio, aprire brevemente la porta e mescolare accuratamente la fiala per evitare la sedimentazione e mantenere la miscela sospesa. Occasionalmente lasciare raffreddare il flaconcino e la soluzione e impedire alla soluzione surriscaldata di toccare la guarnizione.
Utilizzare un termometro a infrarossi per misurare la temperatura della soluzione contenente la porzione del flaconcino. Ripetere il processo a microonde fino a quando la temperatura raggiunge almeno 130 gradi Celsius e tutte le particelle solide sono state completamente sciolte. Quindi, lasciare raffreddare la temperatura della soluzione e del cappuccio del flaconcino al di sotto dei 100 gradi Celsius.
Prima che questa soluzione venga completamente raffreddata, gettarla dalla fiala in geometrie specifiche per formare un idrogel. Dopo aver formato l'idrogel, posizionarlo in un bagno d'acqua e trasferirlo nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Attendere che il bagno sia completamente congelato.
Completare il processo di formazione della spugna rimuovendo l'idrogel congelato e il bagno d'acqua dal congelatore e scongelando a 25 gradi Celsius. Quindi, rimuovere la spugna risultante dall'acqua scongelata. Per preparare un lyogel, trasferire un campione di idrogel congelato in un lyophilizer.
Dopo 24 ore, rimuovere il materiale gel licofilizzato finale dal vaso. Per produrre pellicole di proteina della seta ragno ricombinante, lanciare 200 microlitri della proteina della seta di ragno ricombinante solubilizzata a caldo dal flaconcino a una forma PDMS della forma desiderata. Dopo che è stato asciugato, staccarlo dal substrato PDMS per il test o il trattamento.
Per preparare un rivestimento che non può essere rimosso dal substrato, utilizzare uno spruzzatore di aerografo per applicare la proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante per eseguire un rivestimento spray iniziale sul substrato di scelta. Dopo che è stato asciugato, immergere il substrato rivestito nella proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante per formare un rivestimento di immersione. Ripetere il rivestimento del tuffo per ottenere lo spessore desiderato.
Per formare adesivi, utilizzare una pipetta per aggiungere la proteina solubilizzata della seta di ragno ricombinante su un substrato, quindi applicare un secondo substrato sopra la parte superiore della soluzione. Fissare saldamente i pezzi insieme, quindi asciugare i campioni in un forno con una temperatura minima di 25 gradi Celsius per almeno 16 ore. Per generare fibre filate bagnate, utilizzare un ago di planata calibro 19 e caricare la soluzione di droga solubilizzata in una siringa concentrica con una punta di blocco Luer.
Espellere le bolle d'aria e lasciare che la droga si sieda all'estremità della serratura Luer della siringa. Inserire almeno 25 millimetri di tubi PEEK nei raccordi aderente con un solo pezzo del tubo PEEK per un diametro esterno superiore a 16 pollici e 10 su 32 pettini. Sostituire l'ago calibro 19 con questa configurazione sull'adattatore femmina di blocco Luer della siringa.
Quindi, posizionare guanti di nitrile all'esterno delle divinità intermedie, per evitare che la fibra venga generata dallo scivolamento e per evitare di danneggiare i motori. Ottieni un alto bagno di vetro trasparente con isopropanolo puro al 99% da utilizzare come bagno di coagulazione. Riempire il primo bagno elasticizzato con un rapporto da 80 a 20 di isopropanolo e acqua distillata.
Nel secondo bagno elasticizzato, riempire un rapporto da 20 a 80 di isopropanolo e acqua distillata. Impostare il sistema di estensione godet sul computer. Per regolare la velocità principale della rimozione della fibra, regolare la barra scorrevole per la tripletta godet Una velocità a un valore compreso tra 10 e 14 millimetri al secondo, a seconda di quanto bene e rapidamente la fibra si sta formando.
Inizia un primo tratto spostando la barra scorrevole del rapporto di stiramento b tripla godet a due Per la godet finale nel bagno elasticizzato uno, La godet superiore centrale e la prima godet nel bagno di tratto due. Inizia il secondo tratto spostando la barra scorrevole del rapporto di allungamento della tripla C godet a due per la godet finale nel bagno elasticizzato due, l'ultima godet superiore e il winder. Questa configurazione assicura che la prima godet dopo il bagno di coagulazione e la prima godet nel primo bagno elasticizzato ruotano alla stessa velocità.
Quindi, caricare la soluzione di seta nella siringa di uno strumento di linea di spin personalizzato. Nel sistema automatizzato, impostare la velocità di estrusione a 10 millimetri al secondo, al fine di estrudere la soluzione di seta nel bagno di coagulazione del vetro riempito con isopropanolo. Lasciare che l'estrusione della fibra diventi uniforme, prima di estrarre le fibre dal bagno con un sottile gancio metallico.
Verificare che la rimozione della fibra dal bagno crei un anello tra la punta del tubo PEEK e il percorso della fibra che esce dal bagno. Guida la fibra recuperata attraverso la serie di godet, in modo che la fibra sia immersa nei bagni elastici, ma asciugandosi nell'aria tra i bagni elastici e prima di andare su una bobina. In questo protocollo attraverso una solubilizzazione della proteina della seta di ragno ricombinante, è possibile ottenere una varietà di forme di materiale.
Qui vengono presentate sette forme materiali. Idrogel, liogel, spugna, adesivi, rivestimenti, pellicole e fibre. Le fibre richiedono la lavorazione più estesa estrudendosi in un bagno di coagulazione e quindi allungando serialmente la fibra grezza nei bagni elasticizzati post-bin.
Dato che le soluzioni proteiche e idriche vengono riscaldate a una temperatura e una pressione relativamente elevate, la nostra esperienza è stata che le soluzioni sono sterili nel momento in cui la proteina viene solvata. Ciò consente a qualsiasi forma materiale qui presentata di essere portata alla coltura cellulare, purché siano gestite in modo appropriato, per studiare la risposta cellulare ai materiali. Certamente questa tecnica ha portato alla scoperta di nuove forme di materiale, tra cui adesivi e materiale spugna.
Forme materiali che non sono necessariamente orientate verso la formazione di fibre, anche se la formazione di fibre è una delle aree che ha anche visto miglioramenti attraverso lo sviluppo di questa tecnica. Generare calore e pressione all'interno di una fiala sigillata ha un pericolo intrinseco. Indossare sempre dispositivi di protezione individuale quando si eseguono queste procedure.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
