Bioengineering
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Formación material de la araña recombinante sedas a través de la Solvación acuosa utilizando calor y presión
Chapters
Summary May 6th, 2019
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Aquí, presentamos un protocolo para producir soluciones de proteína de seda de araña recombinante soluble en agua y las formas materiales que se pueden formar a partir de esas soluciones.
Transcript
Este método de solubilización de sedas de araña recombinantes produce formas de materiales que no son posibles utilizando disolventes orgánicos ásperos tradicionales. Además, el proceso es grano, lo que resulta en una solución proteica simple en el agua. Mediante la utilización de este método, los materiales formados o producidos mantienen las características deseables de las proteínas de seda de araña.
Esta técnica de solubilización para sedas de araña recombinantes permite la solubilización de sedas de araña recombinantes en un proceso de un solo paso. Esto es deseable porque estas proteínas notoriamente difíciles de producir no se pierden a través de un procesamiento extenso. Además, dado que las soluciones son sólo proteínas en el agua, se pueden agregar otros compuestos biológicamente activos si eso es deseable para la aplicación.
Particularmente, la relación de función de la estructura proteica, este sistema es memético a cómo una araña hace una fibra en que utiliza agua y proteínas a una alta concentración. Mediante el uso de este método de solubilización y una formación material posterior, debe ser posible obtener comprensión en los materiales que se forman, y las estructuras que son responsables de ellos. Se cree que puede ser, hemos utilizado esta técnica para solubilizar péptidos sintéticos que de otra manera requerirían un ambiente alcalino o ácido para solvate.
Eso puede ser ventajoso en aplicaciones posteriores para esos péptidos. Además, una serie de proteínas conocidas cuando se expresan sintéticamente tienden a terminar en la fracción insoluble. La resolubilización, y luego el refolding de estas proteínas es a menudo un proceso laborioso que resulta en grandes pérdidas.
Mediante la utilización de esta técnica, podría ser posible aumentar la eficiencia de los procesos de recuperación de proteínas insolubles. Colocar un vial sellado en un microondas es un poco desalentador, lo que da el riesgo de sobrecalentamiento y, por lo tanto, sobre presurizar el vial. Comprender el enfoque escalonado para aplicar calor y presión es fundamental.
En segundo lugar, para la seda de araña recombinante en particular, tener sal presente no permitirá que la técnica funcione o funcione con la misma eficacia dependiendo de la cantidad de sal presente. La eliminación de sal es la clave. Tenga paciencia y cuidado, controle de cerca los tiempos y temperaturas del microondas dentro del vial.
Es fundamental porque hay una serie de piezas móviles para el funcionamiento que a menudo son difíciles de transmitir a través de materiales escritos tradicionales y secciones de método. Dado que hay muchas proteínas que tienen problemas de solubilidad que impiden un estudio adecuado, este método tiene potencial para ser aplicado a través de una variedad de espacios proteicos para mejorar, o incluso permitir técnicas analíticas y caracterización. Para comenzar, seleccione un vial de cultivo de vidrio borosilicato limpia y nuevo de ocho mililitros con una tapa de tornillo forrada de goma y coloque el vial vacío en un equilibrio analítico.
Rasgue la masa del vial vacío para que la balanza diga masa cero. Agregue el polvo de proteína de seda de araña recombinante liofilizado deseado al vial vacío para el material específico. A continuación, añada la cantidad deseada de agua ultra pura, al menos dos mililitros, al vial.
Selle la tapa del vial y vórtice rápidamente el contenido para crear una mezcla de proteína de seda de seda recombinante dispersa y homogénea. Realice una comprobación final de la tapa del vial para asegurarse de que se ha apretado firmemente y de forma segura. A continuación, transfiera la mezcla suspendida de proteína de seda de araña recombinante a un horno microondas convencional con el rango de potencia de 700 a 1500 vatios.
Comience el funcionamiento del microondas con ráfagas de cinco segundos y ajuste la potencia completa encendiendo y apagando manualmente. Después de cada ráfaga, abra brevemente la puerta y mezcle cuidadosamente el vial para evitar la sedimentación y mantenga la mezcla suspendida. Ocasionalmente deje que el vial y la solución se enfríen, y evite que la solución sobrecalentada toque el sello.
Utilice un termómetro infrarrojo para medir la temperatura de la solución que contiene la porción del vial. Repita el proceso de microondas hasta que la temperatura alcance al menos 130 grados centígrados, y todas las partículas sólidas se hayan disuelto por completo. A continuación, deje que la temperatura de la solución y la tapa del vial se enfríen por debajo de 100 grados centígrados.
Antes de que esta solución se enfríe por completo, fundición desde el vial en geometrías específicas para formar un hidrogel. Después de que se forme el hidrogel, colóquelo en un baño de agua y transfiéralo al congelador a menos 20 grados centígrados. Espere hasta que el baño esté completamente congelado.
Completar el proceso de formación de esponjas mediante la eliminación del hidrogel congelado y el baño de agua del congelador, y descongelación a 25 grados centígrados. A continuación, retire la esponja resultante del agua descongelada. Para preparar un liogel, transfiera una muestra de hidrogel congelado a un liofilizador.
Después de 24 horas, retire el material de gel liofilizado final del recipiente. Para producir películas de proteína de seda de araña recombinante, fundó 200 microlitros de la proteína de seda de araña recombinante solubilizada caliente del vial en una forma PDMS de la forma deseada. Después de que se seque, despegelo del sustrato de PDMS para su análisis o tratamiento.
Para preparar un recubrimiento que no se pueda eliminar del sustrato, utilice un pulverizador de aerógrafo para aplicar la proteína de seda de araña recombinante solubilizada para realizar un recubrimiento inicial de pulverización en el sustrato de su elección. Después de que se seque, sumerja el sustrato recubierto en la proteína de seda de araña recombinante solubilizada para formar un recubrimiento de inmersión. Repita el recubrimiento de inmersión para alcanzar el espesor deseado.
Para formar adhesivos, utilice una pipeta para agregar la proteína de seda de araña recombinante solubilizada en un sustrato, y luego aplique un segundo sustrato sobre la parte superior de la solución. Sujete firmemente las piezas y luego seque las muestras en un horno con una temperatura mínima de 25 grados Centígrados durante al menos 16 horas. Para generar fibras hiladas húmedas, utilice una aguja deslizante de calibre 19 y cargue la solución de droga solubilizada en una jeringa concéntrica con una punta de bloqueo Luer.
Expulse las burbujas de aire y deje que la droga se siente en el extremo de bloqueo Luer de la jeringa. Inserte al menos 25 milímetros de tubo PEEK en los accesorios herméticos de una pieza del tubo PEEK para uno de más de 16 pulgadas de diámetro exterior y 10 sobre 32 peines. Sustituya la aguja del calibre 19 por esta configuración en el adaptador hembra luer lock de la jeringa.
A continuación, coloque guantes de nitrilo en el exterior de los godets intermedios, para evitar que la fibra se genere se deslice, y para evitar dañar los motores. Obtenga un baño de vidrio alto y transparente con 99% de isopropanol puro para usar como baño de coagulación. Llene el primer baño elástico con una proporción de 80 a 20 de isopropanol y agua destilada.
En el segundo baño elástico, llenar una proporción de 20 a 80 de isopropanol y agua destilada. Configure el sistema de estiramiento de laet de dios en el ordenador. Para ajustar la velocidad principal de la eliminación de fibra, ajuste la barra deslizante para el triplete godet A velocidad a un valor entre 10 a 14 milímetros por segundo, dependiendo de lo bien y rápidamente que se está formando la fibra.
Inicia un primer estiramiento moviendo la barra deslizante de la relación de estiramiento godet triple B a dos Para la godet final en el baño elástico uno, La godet superior media, y la primera godet en baño elástico dos. Inicia el segundo tramo moviendo la barra deslizante de la relación de estiramiento godet triple C a dos para la godet final en el baño elástico dos, la última godeta superior y la bobinadora. Esta configuración asegura que la primera godet después del baño de coagulación, y la primera godet en el primer baño elástico están girando a la misma velocidad.
A continuación, cargue la solución de seda en la jeringa de un instrumento de línea de centrifugado personalizado. En el sistema automatizado, establezca la tasa de extrusión en 10 milímetros por segundo, con el fin de extruir la solución de seda en el baño de coagulación de vidrio lleno de isopropanol. Deje que la extrusión de fibra se vuelva uniforme, antes de sacar las fibras del baño con un gancho de metal delgado.
Verifique que la extracción de la fibra del baño crea un bucle entre la punta del tubo PEEK y la trayectoria de la fibra que sale del baño. Guía la fibra recuperada a través de la serie de godets, de tal manera que la fibra se sumerge en los baños elásticos, pero secando en el aire entre los baños elásticos, y antes de entrar en un carrete. En este protocolo a través de una solubilización de la proteína de seda de araña recombinante, se puede lograr una variedad de formas materiales.
Aquí se presentan siete formas materiales. Hidrogeles, lyogels, esponjas, adhesivos, recubrimientos, películas y fibras. Las fibras requieren el procesamiento más extenso extruyendo en un baño de coagulación, y luego estirando en serie la fibra cruda en los baños de estiramiento del contenedor posterior.
Dado que las soluciones de proteínas y agua se calientan a una temperatura y presión relativamente altas, nuestra experiencia ha sido que las soluciones son estériles en el momento en que la proteína está solvada. Esto permite que cualquiera de las formas materiales presentadas aquí sea llevada al cultivo celular, siempre y cuando se manejen apropiadamente, para estudiar la respuesta celular a los materiales. Ciertamente esta técnica ha llevado al descubrimiento de nuevas formas de material, incluyendo adhesivos y material de esponja.
Formas materiales que no están necesariamente orientadas hacia la formación de fibra, aunque la formación de fibra es una de las áreas que también ha visto mejoras a través del desarrollo de esta técnica. Generar calor y presión dentro de un vial sellado tiene peligro inherente. Use siempre equipo de protección personal al realizar estos procedimientos.
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