La microscopía de localización de una sola molécula 3D se utiliza para sondear las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de las proteínas etiquetadas fluorescentes mente en células bacterianas vivas. El protocolo experimental y de análisis de datos descrito en este documento determina los comportamientos difusivos prevalentes de las proteínas citosólicas basadas en trayectorias agrupadas de una sola molécula.